【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物分子空间检测领域。具体地，本专利技术提供了检测样品中核酸的空间信息的方法，以及用于所述方法的核酸阵列及产生所述核酸阵列的方法。
技术介绍
1、组织中细胞的空间位置显著影响其功能，为探究这种空间异质性，需要在获知空间坐标的情况下，对细胞的基因组或转录组进行量化及分析。然而要收集较小的组织区域甚至单个细胞用于基因组或转录组分析，非常费力、费钱且精确度低。因此，开发一种能够实现单细胞甚至亚细胞级别、且高通量的检测生物分子(例如核酸)的空间信息(例如，核酸的定位、分布和/或表达)的方法是十分必要的。
技术实现思路
1、为实现核酸的空间检测，现有技术通过将阵列技术与高通量dna测序技术联用，捕获并定位标记组织样本中的核酸，并对其进行测序和分析。为获得能够实现所述目的的芯片，现有技术通过点样或微珠介导的方式将能够捕获核酸的探针固定于芯片。然而，使用微量体积点样系统进行液滴平面点样的点样方式获得的芯片的活性区域大小高达200微米，细胞观测精度仅为20细胞；使用带定位标记的微珠进行平面铺展的微珠方式获得的芯片的活性区域大小达10微米，细胞观测精度仅能达到单细胞，无法实现对亚细胞的定位。本专利技术提供了一种全新的用于核酸空间检测的核酸阵列及其制备方法、以及基于该阵列的核酸空间检测方法，其能够同时实现高精度亚细胞定位和高通量组织定位，具备重大应用价值。
2、核酸阵列的制备
3、在第一方面，本专利技术提供了一种产生用于检测生物样品中核酸的空间信息的核酸阵列的方法
4、(1)提供多种载体序列，每种载体序列包含多个拷贝的载体序列，所述载体序列从5’到3’的方向上包含：定位序列和第一固定序列，
5、所述定位序列具有与该种载体序列在阵列上的位置相对应的独一无二的核苷酸序列；
6、所述第一固定序列允许与其互补的核苷酸序列发生退火并起始延伸反应；
7、(2)将所述多种载体序列连接于固相支持物(例如芯片)表面；
8、(3)提供第一引物，并以所述载体序列为模板，进行引物延伸反应，使得所述载体序列的第一固定序列和定位序列区域形成双链，其中与所述载体序列杂交的链即为第一核酸分子，所述第一核酸分子从5’至3’方向上包含第一固定序列和定位序列的互补序列；其中，所述第一引物在其3’端包含第一固定序列互补区，所述第一固定序列互补区包含所述第一固定序列的互补序列或其片段，且具有3’自由端。
9、在某些实施方案中，所述载体序列、第一核酸分子是单链核酸序列。在某些实施方案中，所述载体序列、第一核酸分子是单链dna序列。
10、在某些实施方案中，在步骤(3)中，在进行延伸反应的同时，对所述载体序列进行测序，从而获得所述载体序列所包含的定位序列的序列信息。
11、在某些实施方案中，在步骤(1)中通过以下步骤提供多种载体序列：
12、(i)提供多种载体模板序列，所述载体模板序列包含所述载体序列的互补序列；
13、(ii)以每种载体模板序列为模板，进行核酸扩增反应，以获得每种载体模板序列的扩增产物，所述扩增产物包含多个拷贝的载体序列。
14、在某些实施方案中，所述扩增选自滚环复制(rca)、桥式pcr扩增、多重链置换扩增(mda)或乳液pcr扩增。
15、在某些实施方案中，进行滚环复制，以获得由所述载体序列的多联体所形成的dnb。在此类实施方案中，在步骤(i)中提供环状模板序列。制备环状核酸分子的方法是本领域的常规方法，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如可以首先获得线性核酸模板，然后通过连接酶(例如dna连接酶)实现线性核酸模板的环化。
16、在某些实施方案中，进行桥式pcr扩增、乳液pcr扩增或多重链置换扩增，以获得由所述载体序列的克隆群形的dna簇。
17、在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：
18、(4)提供第二核酸分子，所述第二核酸分子包含捕获序列；
19、所述捕获序列能够与待捕获核酸的全部或部分杂交，其包括：(a)能够捕获mrna的寡核苷酸序列；和/或，(b)随机或简并的寡核苷酸序列；或，(c)针对特定靶核酸的特异性序列；并且，所述捕获序列具有3’自由端以使所述第二核酸分子能作为延伸引物，
20、(5)将所述第二核酸分子与所述第一核酸分子连接(例如，使用连接酶将所述第二核酸分子与第一核酸分子连接)。
21、在某些实施方案中，所述第二核酸分子是单链核酸序列。在某些实施方案中，所述第二核酸分子是单链dna序列。在某些实施方案中，所述第二核酸分子是单链rna序列。
22、在某些实施方案中，所述第二核酸分子从5’至3’方向上包含固定区和捕获序列，所述固定区包含双链核酸序列，例如双链dna序列。在某些实施方案中，所述第二核酸分子所包含的捕获序列是单链核酸序列，例如单链dna序列或单链rna序列。易于理解的是，在此类实施方案中，所述第二核酸分子具有部分双链结构，也即，其固定区具有双链结构，捕获序列为单链结构。
23、在某些实施方案中，所述双链核酸序列的长度为1bp-50bp，例如10bp-50bp，10bp-40bp或10bp-30bp。
24、在另一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：
25、(4)提供第二核酸分子，所述第二核酸分子从5’至3’方向上包含第二固定序列互补序列和捕获序列；
26、所述第二固定序列互补序列允许与其互补的核苷酸序列发生杂交；
27、所述捕获序列能够与待捕获核酸的全部或部分杂交，其包括：(a)能够捕获mrna的寡核苷酸序列；和/或，(b)随机或简并的寡核苷酸序列；或，(c)针对特定靶核酸的特异性序列；并且，所述捕获序列具有3’自由端以使所述第二核酸分子能作为延伸引物；
28、(5)在允许退火的条件下使所述第二固定序列互补序列与第二固定序列发生杂交，从而将所述第二核酸分子连接至所述载体序列；
29、(6)任选地，将分别杂交在载体序列上的第一核酸分子和第二核酸分子连接(例如，使用连接酶将所述第二核酸分子与第一核酸分子连接)。
30、在此类实施方案中，每个载体序列在其5’端进一步包含第二固定序列，所述第二固定序列允许与其互补的核苷酸序列发生退火。在某些实施方案中，所述第二固定序列允许与其互补的核苷酸序列发生退火并起始延伸反应(例如可作为桥式pcr引物的结合位点)。
31、在某些实施方案中，所述第二核酸分子是单链核酸序列。在某些实施方案中，所述第二核酸分子是单链dna序列。在某些实施方案中，所述第二核酸分子是单链rna序列。
32、在某些实施方案中，所述第二固定序列与定位序列邻接。
33、在某些实施方案中，所述第二固定序列的长度为1bp-50bp，例如10bp-50bp，10bp-40bp，10bp-30bp，或10bp-20bp。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生核酸阵列的方法，所述核酸阵列包括探针，其包括以下步骤：
2.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述载体序列从5’到3’的方向上包含：定位序列和固定序列；
3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述多种载体序列固定于固相支持物(例如芯片)表面；
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述探针引物是第一引物；
5.权利要求1-4任一项所述的方法，在步骤(1)之前进一步包括：
6.权利要求5所述的方法，其中，所述多个拷贝的载体序列是由所述载体序列的多联体所形成的DNB；
7.权利要求5所述的方法，其中，所述多个拷贝的载体序列是由所述载体序列的克隆群形成的DNA簇；
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述载体序列包含：捕获模板序列、定位序列和固定序列，所述捕获模板序列包含捕获序列的互补序列，所述捕获序列能够与待捕获核酸的全部或部分杂交；在步骤(2)中，以所述载体序列为模板进行所述延伸反应，生成第一核酸分子，所述第一核酸分子包含固定序列的互补序
9.权利要求1-7任一项所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中，所述第一核酸分子固定于所述固相支持物表面；
11.权利要求10所述的方法，其中，所述连接子是能够与活化基团(例如NH2)偶联的连接基团，所述固相支持物表面具有活化基团(例如NH2)修饰；
12.权利要求10所述的方法，其中，所述切除区所包含的切割位点是可以通过化学、酶或光化学方法进行受控切割的位点；
13.权利要求1-12任一项所述的方法，其中，所述第一核酸分子还包含唯一分子标识符(UMI)序列，所述UMI序列位于固定序列(例如，第一固定序列)互补序列的5’端；
14.权利要求9所述的方法，其中，所述第二核酸分子还包含UMI序列，所述UMI序列位于捕获序列的5’端；
15.权利要求8所述的方法，其中，所述载体序列进一步包含位于所述捕获模板序列的下游、且位于所述固定序列(例如，第一固定序列)的上游的UMI互补序列，其与UMI序列互补，所述UMI序列是由至少1个(例如至少2个，至少3个，至少4个，或至少5个；例如5-100个)N组成的核苷酸序列，每个N各自独立地为A、C、G和T中的任何一种；
16.权利要求1-15任一项所述的方法，其中，所述固相支持物是芯片；
17.权利要求8-16任一项所述的方法，其中，所述能够捕获mRNA的寡核苷酸序列包括能够与mRNA的poly-A尾杂交的序列；
18.通过权利要求1-17任一项所述的方法制备的核酸阵列；
19.一种试剂盒，其包含权利要求18所述的核酸阵列；
20.一种对待测样品中核酸分子进行空间信息标记的方法，其包括以下步骤：
21.权利要求20所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述载体序列进一步包括能够捕获待测样品中的核酸的捕获序列的互补序列，或者捕获模板序列，从而所述第一核酸分子进一步包括捕获序列；
22.权利要求20或21任一项所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述捕获序列以待测样品的核酸或其互补序列为模板起始延伸反应，得到空间信息标记的核酸分子；和/或，所述待测样品的核酸或其互补序列以第一核酸分子为模板起始延伸反应，获到空间信息标记的核酸分子；
23.权利要求22所述的方法，其中，所述延伸反应还包括以TSO序列为模板的进一步延伸，所述空间信息标记的核酸分子的3’端带有TSO序列的互补序列；
24.权利要求20所述的方法，其中，所述方法的步骤(2)包括：
25.权利要求24所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
26.一种检测待测样本中核酸的空间信息的方法，所述方法包括以下步骤：
27.权利要求26所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
28.权利要求20-27任一项所述的方法，其中，所述探针引物还包括切除区，从而由所述探针引物延伸获得的第一核酸分子包括所述切除区；
...【技术特征摘要】
1.一种产生核酸阵列的方法，所述核酸阵列包括探针，其包括以下步骤：
2.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述载体序列从5’到3’的方向上包含：定位序列和固定序列；
3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述多种载体序列固定于固相支持物(例如芯片)表面；
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述探针引物是第一引物；
5.权利要求1-4任一项所述的方法，在步骤(1)之前进一步包括：
6.权利要求5所述的方法，其中，所述多个拷贝的载体序列是由所述载体序列的多联体所形成的dnb；
7.权利要求5所述的方法，其中，所述多个拷贝的载体序列是由所述载体序列的克隆群形成的dna簇；
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述载体序列包含：捕获模板序列、定位序列和固定序列，所述捕获模板序列包含捕获序列的互补序列，所述捕获序列能够与待捕获核酸的全部或部分杂交；在步骤(2)中，以所述载体序列为模板进行所述延伸反应，生成第一核酸分子，所述第一核酸分子包含固定序列的互补序列、定位序列的互补序列和捕获序列；
9.权利要求1-7任一项所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中，所述第一核酸分子固定于所述固相支持物表面；
11.权利要求10所述的方法，其中，所述连接子是能够与活化基团(例如nh2)偶联的连接基团，所述固相支持物表面具有活化基团(例如nh2)修饰；
12.权利要求10所述的方法，其中，所述切除区所包含的切割位点是可以通过化学、酶或光化学方法进行受控切割的位点；
13.权利要求1-12任一项所述的方法，其中，所述第一核酸分子还包含唯一分子标识符(umi)序列，所述umi序列位于固定序列(例如，第一固定序列)互补序列的5’端；
14.权利要求9所述的方法，其中，所述第二核酸分子还包含umi序列，所述umi序列位于捕获序列的5’端；
15.权利要求8所述的方法，其中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈奥，徐讯，杨晋，刘龙奇，王欧，黎宇翔，廖莎，唐国鑫，江媛，徐崇钧，倪鸣，章文蔚，拉多杰·德马纳克，斯内扎娜·德马纳克，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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