【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及使用切割双链体内rna的酶来选择性地将大rna分子切割成预定大小的片段，从而用于多核苷酸分析。
技术介绍
1、mrna正被用作一种新的治疗方法，包括在疫苗和蛋白质替代疗法中使用。在mrna治疗剂的酶促制造过程期间，不完全的mrna产物与其他潜在杂质诸如双链rna(dsrna)一起生成。此外，在制造和储存期间，rna会因暴露于热、水解、氧化、光和核糖核酸酶而降解。批次制造也可能给治疗带来可变性。因此，为了保证质量，需要分析所制造的mrna。
2、典型的mrna长度为约2,000-5,000个核苷酸(0.6mda-1.5mda)。此类大分子难以通过传统的多核苷酸分析方法(包括寡核苷酸分离和质谱分析方法)来表征。此类表征和定量对于评估合成的纯度以及确定治疗性多核苷酸的药代动力学和药效学参数而言可能是必需的。为了克服较大多核苷酸的表征限制，通常首先将它们消化成较小(较短)片段用于分析。然而，非常小的片段可能难以准确映射，因此可能提供较少信息，特别是对于一级序列而言。因此，可存在可促进多核苷酸分析的片段大小的最佳范围。然而，目前没有足够的方法可用于将较大多核糖核苷酸(例如，mrna)分割成合适或最佳大小的片段，以用于多核苷酸分析。
3、因此，需要改进表征大多核糖核苷酸的方法。更具体地，需要能够有效地将多核糖核苷酸消化成具有更可控长度分布的片段的多核糖核苷酸消化方法，诸如更适合于多核苷酸分析(包括例如通过液相色谱和/或质谱分析)并且足以适用于具有可变序列同一性的多核糖核苷酸(例如，mrna)的那些方法。p>
技术实现思路
1、本文的公开内容总体涉及用于消化和表征大rna分子的改进的方法、试剂盒和系统。大rna分子难以通过传统方法(包括液相色谱和质谱分析)表征。将大rna分子消化成较小片段，特别是用序列特异性核酸酶消化，可允许更容易地表征和映射rna片段，但是无限制地切割rna，特别是用选择性较低的核糖核酸酶(识别短基序)进行切割可能导致片段太小而不能有效映射和/或多个同量异位素片段难以区分。本文所述的技术涉及选择性地与单链rna形成寡核苷酸双链体，使得常规上不用于切割单链rna的核酸酶(包括传统上已知仅切割双链dna的核酸酶)可被重新用于以位点特异性方式选择性地将大rna分子切割成可控/预定大小的片段。因此，来自消化的rna片段的精确大小范围可被定制用于多核苷酸分析，包括通过液相色谱和/或质谱分析。
2、根据本公开的一个方面，本文提供了一种将具有已知参考序列的rna分子消化成较小rna片段的方法。该方法需要沿着参考序列的特定部分与rna分子形成一种或多种寡核苷酸双链体。然后用一种或多种序列特异性核酸酶将rna分子消化成片段，该一种或多种序列特异性核酸酶在多个预定的序列特异性位点处切割rna分子。一种或多种序列特异性核酸酶是仅作用于双链体内的rna的双链体依赖性核酸酶。与rna分子形成的一种或多种双链体中的每一种双链体具有由一种或多种双链体依赖性核酸酶中的一种双链体依赖性核酸酶识别的基序。该方法的实施方案可包括以下特征中的一个或多个特征。
3、该方法可使用多种序列特异性核酸酶来消化rna分子。该多种核酸酶可以是多种双链体依赖性核酸酶。序列特异性双链体依赖性核酸酶可以是限制性内切核酸酶、cas蛋白、人工位点特异性rna内切核酸酶(arse)、包括rnase iii结构域的酶或脱氧核酶。作为限制性内切核酸酶的双链体依赖性核酸酶可以是avaii、avrii、bani、taqi、hinfi或haeiii。使用的其他序列特异性核酸酶可以是rnase t1、rnase a、大肠杆菌素e5或mazf。
4、rna分子可具有大于约1,000mer的长度。在一些实施方案中，rna片段的长度可为约6mer至1,000mer，更具体地长度为约6mer至500mer，甚至更具体地长度为约6mer至50mer，或进一步具体地长度为约6mer至20mer。在一些实施方案中，rna片段的长度可为约10mer至1,000mer，更具体地长度为约10mer至500mer，甚至更具体地长度为约10mer至50mer，或进一步具体地长度为约10mer至20mer。在一些情况下，rna片段的长度可为约20mer。
5、一种或多种双链体可以是多种双链体。一种或多种双链体中的每一种双链体可由rna分子和长度为约10mer至50mer的另一寡核苷酸形成。一种或多种双链体中的每一种双链体可通过将外源寡核苷酸与rna分子杂交而形成。一种或多种双链体可用dna寡核苷酸形成。
6、序列特异性核酸酶中的至少一种序列特异性核酸酶被固定在固体支持物上。固定化核酸酶可以允许rna分子流通消化的固定化酶反应器(imer)的形式提供。固定在imer内的核酸酶可以不是双链体依赖性核酸酶，并且可用于进一步消化已经用双链体依赖性核酸酶消化的rna片段的选定级分。
7、rna分子可以是mrna分子。多个预定的序列特异性位点可包括在3′聚(a)尾的近侧端部的约100个核苷酸内的位点和/或在5′帽的约100个核苷酸内的位点。
8、该方法还可需要使用液相色谱基于长度分离rna片段中的一个或多个rna片段。该方法还可需要使用质谱分析测量rna片段中的一个或多个rna片段的质量。该方法还可需要将rna片段映射到参考序列。
9、根据本公开的另一方面，本文提供了一种用于将具有参考序列的rna分子消化成较小rna片段的试剂盒。该试剂盒包括多种寡核苷酸。每种寡核苷酸被配置为与rna分子的单个独特部分杂交，并且具有由仅作用于双链体内的rna的序列特异性双链体依赖性核酸酶识别的基序。该试剂盒的实施方案可包括以下特征中的一个或多个特征。
10、寡核苷酸中的每一种寡核苷酸的长度可为约10mer至50mer。在一些实施方案中，寡核苷酸中的每一种寡核苷酸的长度为约15mer至25mer。多种寡核苷酸可包括由不同的序列特异性双链体依赖性核酸酶识别的至少两种基序。试剂盒还可包括一种或多种序列特异性双链体依赖性核酸酶。
11、根据本公开的另一方面，本文提供了另一种用于将rna分子消化成较小rna片段的试剂盒。该试剂盒包括多种序列特异性核酸酶，该多种序列特异性核酸酶中的至少一种序列特异性核酸酶是仅作用于双链体内的rna的双链体依赖性核酸酶，并且该多种序列特异性核酸酶中的至少一种序列特异性核酸酶是作用于单链rna的核糖核酸酶。至少一种双链体依赖性核酸酶可以是或可包括限制性内切核酸酶。
12、根据本公开的另一方面，本文提供了一种用于将rna片段映射到参考序列的系统。该系统具有：检测器，该检测器被配置为定量长度为约20mer至1,000mer的rna寡核苷酸的量；和处理器，该处理器可操作地连接到检测器。处理器被编程为至少部分地基于检测到的rna寡核苷酸的长度或质量将检测到的rna寡核苷酸映射到rna分子的参考序列。将检测到的rna寡核苷酸映射到参考序列需要处理器确定应当通过根据前本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种将具有已知参考序列的RNA分子消化成较小RNA片段的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种序列特异性核酸酶包括多种核酸酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多种核酸酶包括多种双链体依赖性核酸酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体依赖性核酸酶包括限制性内切核酸酶、Cas蛋白、人工位点特异性RNA内切核酸酶(ARSE)、包括RNase III结构域的酶或脱氧核酶中的一者或多者。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种双链体依赖性核酸酶包括选自由AvaII、AvrII、BanI、TaqI、HinfI和HAEIII组成的组的一种或多种限制性内切核酸酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种序列特异性核酸酶包括RNase T1、RNase A、大肠杆菌素E5和MazF中的一者或多者。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA分子具有大于约1,000mer的长度。
8.根据前述权利要求中
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述RNA片段的长度为约10mer至500mer。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述RNA片段的长度为约10mer至100mer。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述RNA片段的长度为约10mer至50mer。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA片段的长度为约20mer。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体包括多种双链体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体中的每一种双链体由所述RNA分子和长度为约10mer至50mer的另一寡核苷酸形成。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体中的每一种双链体通过将外源寡核苷酸与所述RNA分子杂交而形成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体是用DNA寡核苷酸形成的。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶中的至少一种序列特异性核酸酶被固定在固体支持物上。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种固定化核酸酶以允许所述RNA分子流通消化的固定化酶反应器(IMER)的形式提供。
19.根据权利要求18所述的方法，其中固定在所述IMER内的所述核酸酶不是双链体依赖性核酸酶，并且用于在用双链体依赖性核酸酶消化后进一步消化所述RNA片段的选定级分。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA分子是mRNA分子，并且所述多个预定的序列特异性位点包括在3′聚(A)尾的近侧端部的约100个核苷酸内的位点和/或在5′帽的约100个核苷酸内的位点。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括使用液相色谱基于长度分离所述RNA片段中的一个或多个RNA片段。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括使用质谱分析测量所述RNA片段中的一个或多个RNA片段的质量。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述RNA片段映射到所述参考序列。
24.一种用于将具有参考序列的RNA分子消化成较小RNA片段的试剂盒，所述试剂盒包括多种寡核苷酸，其中每种寡核苷酸被配置为与所述RNA分子的单个独特部分杂交，并且包括由仅作用于双链体内的RNA的序列特异性双链体依赖性核酸酶识别的基序。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸中的每一种寡核苷酸的长度为约10mer至50mer。
26.根据权利要求24或25所述的试剂盒，其中所述多种寡核苷酸包括由不同的序列特异性双链体依赖性核酸酶识别的至少两种基序。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括一种或多种所述序列特异性双链体依赖性核酸酶。
28.一种用于将RNA分子消化成较小RNA片段的试剂盒，所述试剂盒包括多种序列特异性核酸酶，所述多种序列特异性核酸酶包括仅作用于双链体内的RNA的一种或多种双链体依赖性核酸酶和作用于单链RNA的一种或多种核糖核酸酶。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述一种或多种双链体依赖性核酸酶包括限制性内切核酸酶。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种将具有已知参考序列的rna分子消化成较小rna片段的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种序列特异性核酸酶包括多种核酸酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多种核酸酶包括多种双链体依赖性核酸酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体依赖性核酸酶包括限制性内切核酸酶、cas蛋白、人工位点特异性rna内切核酸酶(arse)、包括rnase iii结构域的酶或脱氧核酶中的一者或多者。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种双链体依赖性核酸酶包括选自由avaii、avrii、bani、taqi、hinfi和haeiii组成的组的一种或多种限制性内切核酸酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种序列特异性核酸酶包括rnase t1、rnase a、大肠杆菌素e5和mazf中的一者或多者。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述rna分子具有大于约1,000mer的长度。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述rna片段的长度为约10mer至1,000mer。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述rna片段的长度为约10mer至500mer。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述rna片段的长度为约10mer至100mer。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述rna片段的长度为约10mer至50mer。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述rna片段的长度为约20mer。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体包括多种双链体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体中的每一种双链体由所述rna分子和长度为约10mer至50mer的另一寡核苷酸形成。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体中的每一种双链体通过将外源寡核苷酸与所述rna分子杂交而形成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种双链体是用dna寡核苷酸形成的。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶中的至少一种序列特异性核酸酶被固定在固体支持物上。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种固定化核酸酶以允许所述rna分子流通消化的固定化酶反应器(imer)的形式提供。
19.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·吉拉尔，C·多尼努，M·A·劳伯，M·M·盖伊，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：
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