【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因测序，具体是涉及一种用于ngs测序的线性化方法、测序芯片以及测序方法。
技术介绍
1、下一代测序(ngs)技术在高通量基因组测序中具有广泛应用，其中桥式扩增和线性化过程是其关键步骤。桥式扩增在芯片表面生成双链dna簇，线性化的目的是切除其中一条dna链，保留另一条单链dna作为测序模板(参见图1)。尤其在双端测序中，线性化过程对测序的准确性和效率有着直接影响。
2、边合成边测序(sequencingby synthesis，sbs)是下一代测序技术中广泛应用的一种方法。其原理基于边合成边测序，即通过逐步合成互补dna链，实时检测核苷酸的引入顺序来进行碱基测序。具体流程如下：
3、(一)样本制备与桥式扩增：首先，dna样本被随机打断成较短的片段，并在末端连接上特定的引物序列。接下来，这些片段通过引物与测序芯片表面上的引物结合，在桥式扩增过程中，形成大量的双链dna簇，构成测序的模板。
4、(二)线性化：在桥式扩增后，通过线性化步骤将双链dna切除其中一条链，只保留另一条单链dna与芯片表面固定。此时，单链dna将作为测序模板。
5、(三)引物结合与dna合成：接着，测序引物与固定在芯片表面的单链dna结合，sbs反应开始。通过dna聚合酶逐步加入含有可逆末端终止子(reversible terminator)的荧光标记核苷酸，每次只加入一个碱基。由于末端终止子限制了进一步的链延伸，每次只有一个核苷酸可以被加入。
6、(四)荧光信号检测：每次核苷酸的引入伴
7、重复上述(三)和(四)的步骤，直到序列完成。
8、(五)数据处理与碱基调用：随着每个簇的测序反应进行，系统通过分析不同荧光信号的强度与颜色，逐步解析每个dna簇中的碱基序列，生成最终的dna序列数据。
9、在上述测序过程中，线性化过程的效率直接影响后续测序的质量。在桥式扩增后的线性化步骤中，如果能够高效地切除一条dna链并保留另一条链作为测序模板，固定在芯片表面上的可用的单链dna模板数量将会更多。这意味着在sequencingby synthesis(sbs)过程中，每个簇中的dna分子数较多，生成的荧光信号也更强，从而提高信号的强度和信噪比(snr)。信号更清晰，基线更稳定，能够显著提高碱基读取(basecalling)的准确性。反之，如果线性化效率较低，可用于测序的单链模板数量将减少，导致每个簇产生的荧光信号不够强，信噪比下降。这种情况下，测序仪难以准确区分不同的荧光信号，碱基调用时容易产生错误，进而影响最终的测序质量。因此，优化线性化步骤对于提高测序精度和减少错误率至关重要。
10、目前常用的线性化方法有如下三种：
11、user酶切除法：这种方法在芯片表面的引物中引入u碱基(尿嘧啶)，然后使用user酶(尿嘧啶dna糖基化酶及内切酶)来切除含有u碱基的一条dna链。user酶的方法是目前效率最高且对dna损伤最小的线性化手段，因而被广泛应用于测序流程中。
12、fpg酶切除法：这种方法在芯片表面的引物中引入8-oxo-g碱基，通过fpg酶(表皮葡糖基化酶)识别并切除含有该特殊碱基的dna链。虽然fpg酶对dna的损伤较小，但其在芯片表面切除dna链的效率不如user酶高，并且效率不稳定，这在高密度簇状结构中会影响测序模板的均匀性和准确性，导致测序质量也不稳定。
13、高碘酸钠化学切割法：第三种方法是化学切割，通过在寡核苷酸引物中引入二元醇官能团，将引物固定在芯片表面。线性化时，使用高碘酸钠处理芯片表面，高碘酸钠能够切割二元醇，从而去除一条dna链。虽然这种方法的切割效率较高，但高碘酸钠作为强氧化剂会对dna产生较大的损伤，影响测序的准确性和数据质量。
14、可见，上述三种方法各有优缺点，并且在双端测序中，常常需要同时使用两种不同的线性化方法，以分别切割两个方向的dna链，这使得线性化过程更加复杂且要求更高。然而，目前最常用的user酶切除法虽然效率高且损伤低，但无法单独解决双端测序的需求；而fpg酶切除法的效率不够理想，高碘酸钠则对dna的破坏性较强。因此，现有线性化方法在双端测序的应用中仍存在明显的局限性，亟需开发新的、高效且损伤小的线性化方法，以提高双端测序的整体性能。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的是提供一种新的、高效且对dna损伤小的线性化方法，以提高测序(尤其是双端测序)的整体性能。
2、实现上述目的的技术方案包括如下。
3、第一个方面，本专利技术提供了一种新的用于ngs测序的线性化方法，包括如下步骤：
4、在dna引物中引入单个核糖核苷，所述核糖核苷的2’-oh位置修饰有羟基保护基团；
5、线性化时，用切割试剂去除所述羟基保护基团，暴露核糖核苷的2’-oh；
6、切断核糖核苷位置的磷酸二脂键，导致dna引物中的一条链断裂；
7、其线性化反应式如下：
8、
9、其中，r为羟基保护基团；base为杂环碱基；所述切割试剂是能够脱除所述核糖核苷中的r基团的化学试剂。
10、其中，r可以选自但不限于如下基团：氨基、
11、
12、其中，r1、r2和r3分别独立选自：h、c1-c6烷基、c3-c8环烷基、苯基取代的c1-c6烷基、卤素取代的c1-c6烷基；
13、r4选自：氰基甲基、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、卤素、c1-c6烷氧基、r6取代或者未取代的c6-c10芳基、r6取代或者未取代的5-10元杂芳基；
14、r5选自：c1-c6烷基、c3-c8环烷基、苯基取代的c1-c6烷基、卤素取代的c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤素取代的c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷胺基、r6取代或者未取代的c6-c10芳基、r6取代或者未取代的5-10元杂芳基；
15、r6选自：c1-c6烷基、氰基、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、卤素、c3-c8环烷基、苯基取代的c1-c6烷基、卤素取代的c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤素取代的c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷胺基。
16、base可以选自：腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶，甲基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，异鸟嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假尿嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，次黄嘌呤，r7取代的腺嘌呤，r7取代的鸟嘌呤，r7取代的胞嘧啶，r7取代的尿嘧啶，r7取代的胸腺嘧啶等等；其中，r7选自：h，苯甲酰基，卞氧基甲基。
17、第二个方面，本专利技术提供了一种ngs测序芯片，所述ngs测序芯片表面连接有至少一种dna引物，其中至少一种dna引物中引入了单个核糖核苷，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，R选自氨基或者如下基团：
3.根据权利要求1所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，Base选自：腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶，甲基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，异鸟嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假尿嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，次黄嘌呤，R7取代的腺嘌呤，R7取代的鸟嘌呤，R7取代的胞嘧啶，R7取代的尿嘧啶，R7取代的胸腺嘧啶；其中，R7选自：H，苯甲酰基，卞氧基甲基。
5.根据权利要求1所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，R为烯丙基，所述切割试剂为钯催化剂；
6.根据权利要求5所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，用切割试剂去除所述羟基保护基团包括：将所述DNA引物与钯催化剂溶液孵育；
7.根据权利要求6所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，
8.根据权利要
9.根据权利要求1-8任一项所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，切断核糖核苷位置的磷酸二脂键包括：用RNase识别并切断核糖核苷位置的磷酸二脂键，或者用碱性试剂切断核糖核苷位置的磷酸二脂键；所述RNase优选为RNaseHII、RNaseHI或者RNaseHIII。
10.根据权利要求9所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，所述用RNase识别并切断核糖核苷位置的磷酸二脂键包括：将暴露核糖核苷2’-OH的DNA引物与RNase溶液孵育；
11.根据权利要求10所述的用于NGS测序的线性化方法，其特征在于，所述RNaseHII在所述RNase溶液中的酶活为0.1U/uL～5U/uL，优选为0.5U/uL～1.5U/uL，优选为0.7U/uL～1.0U/uL；和/或，
12.一种NGS测序芯片，其特征在于，所述NGS测序芯片表面连接有至少一种DNA引物，其中至少一种DNA引物中引入了单个核糖核苷，所述核糖核苷的2’-OH位置修饰有羟基保护基团；
13.根据权利要求12所述的NGS测序芯片，其特征在于，所述NGS测序芯片表面连接有两种DNA引物，所述两种DNA引物为P5引物和P7引物，所述P7引物中引入了单个核糖核苷，所述核糖核苷的2’-OH位置修饰有羟基保护基团；所述P5引物序列中间带有dU碱基修饰；
14.一种权利要求12或13所述的NGS测序芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
15.权利要求1-11任一项所述的线性化方法、或者权利要求12或13所述的NGS测序芯片在NGS测序中的应用；优选地，所述NGS测序为双端NGS测序。
16.一种NGS测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
17.一种双端NGS测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
18.根据权利要求16或17所述的NGS测序方法，其特征在于，R为烯丙基，所述切割试剂为钯催化剂；
19.根据权利要求18所述的NGS测序方法，其特征在于，所述切割试剂溶液为含有Na2PdCl4和P(PhSO3Na)3的缓冲溶液；
20.根据权利要求16或17所述的NGS测序方法，其特征在于，所述RNase为RNase HII、RNase HI或者RNase HIII。
21.根据权利要求20所述的NGS测序方法，其特征在于，所述RNase溶液为含有RNaseHII的缓冲溶液；
...【技术特征摘要】
1.一种用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，r选自氨基或者如下基团：
3.根据权利要求1所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，base选自：腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶，甲基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，异鸟嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假尿嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，次黄嘌呤，r7取代的腺嘌呤，r7取代的鸟嘌呤，r7取代的胞嘧啶，r7取代的尿嘧啶，r7取代的胸腺嘧啶；其中，r7选自：h，苯甲酰基，卞氧基甲基。
5.根据权利要求1所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，r为烯丙基，所述切割试剂为钯催化剂；
6.根据权利要求5所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，用切割试剂去除所述羟基保护基团包括：将所述dna引物与钯催化剂溶液孵育；
7.根据权利要求6所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，
8.根据权利要求6所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，所述钯催化剂溶液中的缓冲液为thermopoli、tris、mops、hepes、或者te缓冲液；和/或，
9.根据权利要求1-8任一项所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，切断核糖核苷位置的磷酸二脂键包括：用rnase识别并切断核糖核苷位置的磷酸二脂键，或者用碱性试剂切断核糖核苷位置的磷酸二脂键；所述rnase优选为rnasehii、rnasehi或者rnasehiii。
10.根据权利要求9所述的用于ngs测序的线性化方法，其特征在于，所述用rnase识别并切断核糖核苷位置的磷酸二脂键包括：将暴露核糖核苷2’-oh的dna引物与rnase溶液孵育；
【专利技术属性】
技术研发人员：刘二凯，玄曙光，陆永艺，徐杰成，
申请(专利权)人：深圳赛陆医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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