【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及酶的抗体偶联寡核苷酸酶促dna原位合成方法。
技术介绍
1、目前在dna合成领域中，利用固相亚磷酰胺技术的化学合成法仍是主流合成技术，该方法的极限合成长度为200-300nt，其合成效率不稳定且会产生有毒废弃物。相较于化学合成法，酶法合成允许在水性环境中进行反应，其反应条件更加温和，且不需使用有毒化合物，使得在任何地方进行 dna 合成成为可能，有望解决化学合成法存在的诸多问题。
2、末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，简称tdt)最早分离于小牛胸腺，其分子量大约为60 kda，并于上世纪八十年代被证实在免疫系统抗体v(d)j 重组中发挥作用，随机合成抗体可变序列区。tdt是一种不依赖模板的单链dna聚合酶，具有无模板依赖的快速聚合活性，整个催化过程中无需经过变性、复性和延伸反应，以一段寡核苷酸为引物，在恒温和金属离子辅助的条件下，催化脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)聚合到寡核苷酸的 3'末端，即可实现长链dna合成。重要的是，tdt对底物的选择性较低，同时对所有dntp均有较快的催化反应速率，任意的dntp、核糖核苷三磷酸（rntp）、修饰的核苷三磷酸类似物(如荧光修饰的dntp、生物素修饰的dntp、人工碱基等)都可作为其底物。除酶促dna合成外，tdt也可做为一个识别和放大信号的媒介而被广泛应用于生物传感器的构建中，用于核酸酶、外泌体、蛋白质以及微小核糖核酸的检测。
3、tdt在固相载体上进行酶促dna合成时，将核苷酸链的
4、抗体偶联寡核苷酸（antibody-oligonucleotide conjugates，简称aoc）是指单克隆抗体和寡核苷酸组成的新型合成生物偶联物，其中抗体部分可以特异性靶向特定细胞表面抗原，寡核苷酸则能够调控目标基因的表达。aoc结合抗体和寡核苷酸的特性被广泛应用于现代生物技术和药物研发等领域。
5、tdt酶可以以模板非依赖方式进行dna原位合成，若可以在aoc的oligo链上合成寡聚核苷酸序列，可通过检测合成序列的有无判断原始样本中抗原信号是否存在，为抗原/抗体检测提供了新的思路，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的主要问题是如何在不依赖于模板情况下，进行抗体偶联寡核苷酸的制备。
2、为了解决上述问题，本专利技术提供了抗体偶联寡核苷酸的原位合成的方法。
3、本专利技术提供的抗体偶联寡核苷酸的原位合成方法，包含以下步骤：
4、1）寡核苷酸合成：化学法合成寡核苷酸链；
5、2）抗体和寡核苷酸偶联：将步骤1）所述寡核苷酸通过共价键与所述抗体偶联；
6、3）tdt酶促ssdna原位合成 ：以脱氧核糖核苷三磷酸单体为原料，采用tdt酶在寡核苷酸3’-oh端进行延伸，获得酶促ssdna原位合成产物。
7、上述方法中，步骤2）中所述偶联采用寡核苷酸偶联试剂盒（杭州乐为生医科技有限公司，货号lw-aoc-010）进行。
8、上述方法中，步骤3）中所述tdt酶可在dna链末端添加核苷酸，在dna的复制和修复过程中起重要作用，在体内参与v(d)j重组、dna修复等重要生理学过程。
9、本文中，由于tdt酶对底物选择性较低，可以使用荧光修饰以及电化学修饰的核苷酸为底物进行aoc的原位合成，以化学修饰的dntp为原料合成的原位合成产物与目标抗原结合后，可使用电化学发光仪进行荧光强度检测，有助于细胞或组织中靶蛋白的定位定量分析。
10、上述方法中，步骤3）所述ssdna原位合成使用的dntp可为化学修饰的dntp。
11、进一步地，所述化学修饰的基团位置位于碱基a、g、c、t上的-nh2基团。
12、上述方法中，步骤3）所述ssdna原位合成反应体系为：6μl抗体（终浓度为2ng/ml）、3μl 10×tris-hcl（终浓度为0.1m）、3μl cocl2 （终浓度为1mm）、3μl triton（终浓度为0.1%）、3μl dntp（终浓度为0.5mm）、3μl tdt（终浓度为0.5mg/ml），ddh2o补足至30μl。
13、上述方法中，步骤3）所述的原位合成反应条件为：30℃，10min；98℃，2min。
14、上述方法中，步骤2）所述抗体和寡核苷酸偶联的步骤如下：
15、1）对所述寡核苷酸活化；
16、2) 对活化后的寡核苷酸进行纯化，得到纯化后的寡核苷酸；
17、3）对所述抗体进行活化；
18、4）对所述抗体脱盐纯化，获得纯化后抗体；
19、5）抗体寡核苷酸偶联：将步骤4）中获得的所述纯化后抗体与步骤2）中获得的所述寡核苷酸按照1:5的摩尔比进行偶联反应，4℃避光反应12小时，得到复合物，所述复合物为偶联所述寡核苷酸的抗体偶联物。
20、所述抗体偶联物中，所述寡核苷酸的5'端连接至所述抗体。
21、本专利技术还提供了前文所述方法制备的原位合成产物。
22、本专利技术还提供了tdt酶在抗体偶联寡核苷酸酶促ssdna原位合成中的应用。
23、本专利技术还提供了前文所述原位合成方法在抗体偶联寡核苷酸酶促ssdna原位合成中的应用。
24、前文所述原位合成方法在增强抗体识别能力中的应用也属于本专利技术要求保护的范围。
25、本专利技术还提供了前文所述的合成产物在增强抗体识别能力中的应用。
26、本专利技术提出了一种创新的生物材料固定相—抗体，通过将寡核苷酸的5'端连接至抗体，形成复合物，在复合物的寡核苷酸的3'端利用tdt酶进行原位合成。特异性结合至靶蛋白的抗体作为tdt合成的新型合成载体，通过其特异性识别能力，为生物信号的放大提供了一种新的策略。
27、本专利技术通过将抗体载体与tdt酶扩增相结合，提高了抗体偶联寡核苷酸的原位合成效率及稳定性，同时使用tdt酶来催化化学修饰的dntp进行dna合成，这为tdt酶的扩增信号能够以电化学的形式输出提供了可能。
28、本专利技术提出的工艺流程具有以下优势：
29、1）酶促反应高效：本专利技术在现有抗体偶联核酸的技术基础上进行酶促ssdna原位合成，所使用的tdt酶是不依赖于模板的合成酶，该酶在恒温条件下即可完成ssdna的延长，不需要复杂的热循环系统，减少了合成步骤；
30、2）通量高：本专利技术的工艺流程步骤简单，且过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗体偶联寡核苷酸的ssDNA原位合成的方法，其特征在于，包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述ssDNA原位合成使用的dNTP为常规dNTP或化学修饰的dNTP。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述化学修饰的基团位置位于A、G、C或T碱基上的NH2基团。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3）所述ssDNA原位合成反应体系为：6μL抗体，终浓度为2ng/mL；3μL 10×Tris-HCl，终浓度为0.1M；3μLCoCl2 ，终浓度为1mM；3μL Triton，终浓度为0.1%；3μL dNTP，终浓度为0.5mM；3μL TdT，终浓度为0.5mg/mL；ddH2O补足至30μL；
5.权利要求1所述方法制备得到的原位合成产物。
6.TdT酶在抗体偶联寡核苷酸酶促ssDNA原位合成中的应用。
7.权利要求1所述的方法在抗体偶联寡核苷酸酶促ssDNA原位合成中的应用。
8.权利要求1所述的方法在增强抗体识别能力中的应用。
<...【技术特征摘要】
1.抗体偶联寡核苷酸的ssdna原位合成的方法，其特征在于，包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述ssdna原位合成使用的dntp为常规dntp或化学修饰的dntp。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述化学修饰的基团位置位于a、g、c或t碱基上的nh2基团。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3）所述ssdna原位合成反应体系为：6μl抗体，终浓度为2ng/ml；3μl 10×tris-hcl，终浓度为0.1m；3μlcocl2 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘力沛，徐自如，杨城，刘岩岩，逯晓云，孙隽，
申请(专利权)人：天津中合基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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