本发明专利技术公开了一种检测诱导多能干细胞分化潜能的荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒，该检测方法包括以下步骤：S1、利用iPSC制备拟胚体；S2、提取iPSC与所述拟胚体的RNA；S3、将iPSC与拟胚体的RNA分别反转录为cDNA；S4、采用权利要求1所述引物组合物建立荧光定量PCR反应体系；S5、对S3中所述cDNA进行荧光定量PCR检测；S6、结果分析。利用本发明专利技术检测试剂盒能够快速、准确的评估诱导多能干细胞的分化潜能，适用于大规模的细胞分化研究和临床应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞及分子生物检测领域，尤其涉及一种检测诱导多能干细胞(ipsc)分化潜能的荧光定量pcr检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
1、诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell，ipsc)是一种通过将特定转录因子导入终末分化的体细胞中重编程而来的多能性细胞，该技术最早是由日本京都大学的山中伸弥教授于2006年实现的，通过将四个转录因子(oct4、sox2、klf4和c-myc)通过病毒载体转入小鼠成体细胞中，最终获得具有分化潜能的ipsc细胞
2、ips细胞具有与胚胎干细胞相似的特性，其分化潜能是最显著的特性之一，可用于分化产生包括造血细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经元等各种细胞类型，并被广泛应用于再生医学、疾病建模、药物筛选等领域中。
3、作为多能干细胞，ips细胞能够自我更新、维持未分化状态并具有多向分化潜能，其干性和多向分化潜能是评价该类型细胞生物学有效性的基础，同时也是判断分化细胞生物学安全性的标准。
4、ips细胞的多能性和分化潜能可以通过多种指标来表征，包括形态学、标志分子表达、三胚层分化、端粒酶活性、畸胎瘤形成等。其中，拟胚体(embryoid body)形成实验是体外判断ips细胞多能性的一种常见方法，通过悬浮培养的方式可诱导细胞自发形成类似球形的细胞团，通过检测内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)、外胚层(ectoderm)三个胚层代表基因表达情况，可进一步研究和验证ips细胞的多向分化潜能。
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br/>技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测诱导多能干细胞(ipsc)分化潜能的荧光定量pcr检测方法及检测试剂盒，利用本专利技术检测试剂盒能够快速、准确的评估诱导多能干细胞的分化潜能，适用于大规模的细胞分化研究和临床应用。
2、为了实现上述目的，本申请采用了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种检测诱导多能干细胞(ipsc)分化潜能的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于检测ipsc分化潜能的引物组合物；
4、诱导ipsc形成拟胚体，所述拟胚体具有三胚层，分别为外胚层、中胚层和内胚层，
5、外胚层标志基因包括cdh9、col2a1、dlk1、dmbx1、drd4、en1、fabp7、hes5、lhx2、lmx1a、map2、myo3b、ncam1、nes、nos2、nr2f1、nr2f2、olfm3、otx2、pamr1、papln、pax3、pax6、pou4f1、prkca、rax、sdc2、sox1、tfap2a、trpm8、wnt1、zbtb16，
6、中胚层标志基因包括abca4、alox15、aplnr、bmp10、cdh5、cdx2、colec10、cxcr4、des、esm1、fcn3、foxf1、hand1、hand2、hey1、hopx、hoxb7、il6st、isl1、meox1、mixl1、ncam1、nkx2-5、odam、pdgfra、plvap、rgs4、snai2、t、tbx3、tbx6、tm4sf1，
7、内胚层标志基因包括afp、cabp7、cdh20、cer1、cldn1、cplx2、cxcr4、elavl3、eomes、foxa1、foxa2、foxp2、gata4、gata6、gsc、hhex、hmp19、hnf1b、hnf4a、kit、klf5、lefty1、lefty2、nodal、phox2b、pou3f3、prdm1、rxrg、sox17、sox7、sst，
8、每个胚层选取2-3个标志基因，同时选取gapdh为内参基因，所述引物组合物包括针对每个胚层所选取的标志基因以及内参基因gapdh的引物。
9、在以上技术方案中，每个胚层选取2个标志基因，外胚层选取ncam1和pax6，中胚层选取cdx2和meox1，内胚层选取afp和sox17，同时选取gapdh为内参基因；
10、所述引物组合物包括
11、针对内参基因gapdh的引物：上游引物如seq id no：1所示，下游引物如seq idno：2所示；
12、针对外胚层靶标基因ncam1的引物：上游引物如seq id no：2所示，下游引物如seqid no：4所示；
13、针对外胚层靶标基因pax6的引物：上游引物如seq id no：5所示，下游引物如seqid no：6所示；
14、针对中胚层靶标基因cdx2的引物：上游引物如seq id no：7所示，下游引物如seqid no：8所示；
15、针对中胚层靶标基因meox1的引物：上游引物如seq id no：9所示，下游引物如seqid no：10所示；
16、针对内胚层靶标基因afp的引物：上游引物如seq id no：11所示，下游引物如seqid no：12所示；
17、针对内胚层靶标基因sox17的引物：上游引物如seq id no：13所示，下游引物如seq id no：14所示。
18、在以上技术方案中，所述检测试剂盒主要由试剂a和试剂b组成；
19、试剂a为荧光定量pcr反应预混液，包括高特异性qpcr试剂tb green premix extaq ii，rox reference dye内参染料，无核酶水，以及权利要求1所述引物组合物；
20、试剂b为对照品，包含ipsc cdna和拟胚体cdna。
21、第二方面，本专利技术提供了一种检测诱导多能干细胞分化潜能的荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：
22、s1、利用ipsc制备拟胚体；
23、s2、提取ipsc与所述拟胚体的rna；
24、s3、将ipsc与拟胚体的rna分别反转录为cdna；
25、s4、采用权利要求1所述引物组合物建立荧光定量pcr反应体系；
26、s5、对s3中所述cdna进行荧光定量pcr检测；
27、s6、结果分析。
28、在以上技术方案中，s4中，所述荧光定量pcr反应体系为20μl，包含18μl的试剂a和2μl的试剂b；所述试剂a为荧光定量pcr反应预混液，包括高特异性qpcr试剂tb greenpremix ex taq ii，rox reference dye内参染料，无核酶水，以及权利要求1所述引物组合物；所述试剂b为对照品，包含ipsc cdna和拟胚体cdna。
29、在以上技术方案中，s4中，所述荧光定量pcr反应体系的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
30、在以上技术方案中，s6中，以ipsc未分化细胞作为对照，通过内参基因，计算各个胚层基因的相对表达量，计算差异倍数，以判断ipsc的分化潜能。
31、在以上技术方案中，相对本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种检测诱导多能干细胞(iPSC)分化潜能的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括用于检测iPSC分化潜能的引物组合物；
2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于：每个胚层选取2个标志基因，外胚层选取NCAM1和PAX6，中胚层选取CDX2和MEOX1，内胚层选取AFP和SOX17，同时选取GAPDH为内参基因；
3.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒主要由试剂A和试剂B组成；
4.一种检测诱导多能干细胞分化潜能的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：S4中，所述荧光定量PCR反应体系为20μL，包含18μL的试剂A和2μL的试剂B；所述试剂A为荧光定量PCR反应预混液，包括高特异性qPCR试剂TB Green Premix Ex Taq II，ROX Reference Dye内参染料，无核酶水，以及权利要求1所述引物组合物；所述试剂B为对照品，包含iPSC cDNA和拟胚体cDNA。
6.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：S4中，所述荧光定量PCR反应体系的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
7.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：S6中，以iPSC未分化细胞作为对照，通过内参基因，计算各个胚层基因的相对表达量，计算差异倍数，以判断iPSC的分化潜能。
8.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于：相对表达量计算公式：
9.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：S1中，利用iPSC制备拟胚体的方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于：诱导分化培养基包括DMEM/F12培养基、KnockOut血清替代物和2-巯基乙醇。
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【技术特征摘要】
1.一种检测诱导多能干细胞(ipsc)分化潜能的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括用于检测ipsc分化潜能的引物组合物；
2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于：每个胚层选取2个标志基因，外胚层选取ncam1和pax6，中胚层选取cdx2和meox1，内胚层选取afp和sox17，同时选取gapdh为内参基因；
3.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒主要由试剂a和试剂b组成；
4.一种检测诱导多能干细胞分化潜能的荧光定量pcr检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：s4中，所述荧光定量pcr反应体系为20μl，包含18μl的试剂a和2μl的试剂b；所述试剂a为荧光定量pcr反应预混液，包括高特异性qpcr试剂tb green premix ex taq ii，rox refer...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，曾炜佳，陈惠，高志建，胡孟军，卢孔鑫，毛馨悦，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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