【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种有效检测细胞系人源foxp3表达水平的重组报告质粒pgl-foxp3 promptor-reporter-foxp3 enhancer及其药物筛选系统构建与应用。
技术介绍
1、调节性t细胞(regulatory t cells，treg)是一类与炎症、自身免疫性疾病及肿瘤等相关的具有免疫抑制功能的t细胞亚群，主要包括来源于胸腺的天然treg细胞(naturalregulatory tcells，ntreg)和在外周发育成熟的诱导型treg细胞(induced regulatory tcells，itreg)，可以调控cd4+t细胞、cd8+t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、apc等的炎症免疫应答。叉头框蛋白p3(forkhead box protein p3，foxp3)是treg细胞发育和功能水平的关键转录因子。研究者在多种自身免疫性疾病患者体内检测到foxp3水平下降或功能缺失，其表达水平下降或功能缺失会引起严重的自身免疫性疾病。因此，foxp3表达水平和功能的检测结果可以一定程度上反映炎症和自身免疫性疾病的严重程度，寻找能调节foxp3水平的药物成为炎症和自身免疫性疾病治疗的一个重要方向。此外，treg在肿瘤的发生发展中起到负性调节的作用。因此，寻找能够降低treg中foxp3水平的药物对肿瘤的治疗也具有一定的意义。
2、然而，目前研究者通过流式细胞仪采用分类计数的手段进行treg数量检测，需要体外分离淋巴细胞或者cd4+t细胞，其操作复杂，仪器、抗体昂贵。对此，报告基因法具有
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测细胞系人源foxp3表达水平的重组报告质粒pgl-foxp3 promptor-reporter-foxp3 enhancer及其药物筛选系统。
2、为实现本专利技术的技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：
3、本专利技术以基础质粒pgl-basic为载体，引入合适的人foxp3启动子与增强子序列，反映内源性基因foxp3表达的水平。通过对人源foxp3基因启动子和增强子进行筛选，将人foxp3的-501-+186区域作为启动子，1800-1922区域作为增强子插入pgl-basic质粒中，并将luc与荧光蛋白基因进行替换得到多种人foxp3报告重组质粒。并验证其能有效在人jurkat细胞系中指示foxp3表达。同时，使用293细胞进行人foxp3报告重组质粒转染、诱导建立药物筛选系统。
4、本专利技术技术方案的第一方面是提供了一种如附图1所示检测细胞系人源foxp3表达水平的luc重组质粒。
5、所述的检测细胞系人源foxp3表达水平的luc重组质粒包括人foxp3启动子序列(序列1“seq_1”)和人foxp3增强子序列(序列2“seq_2”)。
6、该质粒构建步骤如下：1)将目的基因扩增；2)将载体酶切并与多目的片段同源重组；3)所得连接产物转化感受态细胞；4)涂板后菌落pcr鉴定并将提取质粒测序。
7、该质粒应用：由于foxp3报告基因的表达水平由人foxp3启动子和增强子共同控制，该质粒可以通过报告基因的水平反映内源性调控foxp3的水平，从而可应用于机体炎症、自身免疫疾病中treg细胞免疫功能水平的检测
8、本专利技术技术方案的第二方面是提供第一方面所述的将报告基因荧光素酶替换为荧光蛋白egfp，构建检测细胞系人源foxp3表达水平的egfp重组质粒，如附图2所示。
9、该质粒通过将荧光素酶报告基因替换为egfp，从而使用荧光显微镜或者荧光检测仪检测报告基因表达含量。
10、本专利技术仅用egfp进行替代，但可以使用其他报告基因替代荧光素酶基因，比如黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、dsredexpress2、mcherry、morange、mplum黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(ecfp)、以及sapphire。
11、本专利技术技术方案的第三方面是提供了一种能有效在人cd4+细胞系jurkat中应答foxp3信号的的luc重组质粒。
12、具体步骤为：将jurkat细胞以含5％ fbs的1640重悬后，以10万/孔接种于48孔板中，按照lipofectamin 3000转染说明书进行foxp3-luc质粒转染，每孔转染250ngfoxp3-luc质粒，具体为：每孔由lipofectamine 3000 0.4μl与10μl的opti-mem培养基混合后，与含有0.4μl p3000试剂的含有质粒的10μl的opti-mem培养基室温混匀15min后，每孔加入20μl。加入终浓度为20ng/ml的pma培养24h后裂解细胞，g250法测量蛋白浓度并检测发光值。
13、本专利技术技术方案的第四方面是提供了一种以如附图1和附图2所述的luc重组质粒以及egfp质粒建立检测foxp3表达的药物筛选系统与应用。
14、具体步骤为：以dmem完全培养基重悬293细胞，并以5万/孔接种于48孔板中。待细胞汇合度达到70％时，按照lipofectamin 3000转染说明书进行转染foxp3-luc质粒或者foxp3-egfp以及mcherry质粒。每孔转染250ng质粒，具体为：每孔由lipofectamine30000.4μl与10μl的opti-mem培养基混合后，与含有0.4μl p3000试剂的含有质粒(250ngfoxp3-luc质粒或200ngfoxp3-egfp+50ngegfp质粒)的10μl的opti-mem培养基室温混匀15min后，每孔加入20μl。加入待筛选药物培养1-3h后，加入终浓度为20ng/ml的pma或者终浓度为1ng/ml的tnf-α继续培养24h。裂解细胞，g250法测量蛋白浓度并检测发光值或者直接荧光显微镜观察结果。
15、为了完成本专利技术的目的，本专利技术涉及检测人源foxp3表达水平的重组报告质粒在构建的foxp3表达升高的pma刺激293细胞模型以及foxp3表达降低的tnf-α刺激293细胞模型，筛选影响foxp3上调或下调表达药物方面的应用。
16、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告质粒pGL-FOXP3promptor-reporter-FOXP3 enhancer，其特征在于：分别由抗性基因、人FOXP3启动子、报告基因、人FOXP3增强子构成。
2.权利要求1所述的用于检测细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告质粒pGL-FOXP3promptor-reporter-FOXP3 enhancer，其特征在于：所含的抗性基因为氨苄霉素抗性基因。
3.权利要求1所述的用于检测细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告质粒pGL-FOXP3promptor-reporter-FOXP3 enhancer，其特征在于：所述的人FOXP3启动子为人FOXP3基因Eukaryotic promoter database(EPD)-501-+186碱基区域，序列如序列1“Seq_1”所示。
4.权利要求1所述的用于检测细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告质粒pGL-FOXP3promptor-reporter-FOXP3 enhancer，其特征在于：所述的人FOXP3增强子为人
5.权利要求1所述的用于检测细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告质粒pGL-FOXP3promptor-reporter-FOXP3 enhancer，其特征在于：所述的报告基因可以是荧光素酶或者荧光蛋白：绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、DsRedexpress2、mCherry、mOrange、mPlum黄色荧光蛋白(EYFP)、青色荧光蛋白(ECFP)、以及Sapphire。
6.权利要求1-3中任一项所述的细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告重组质粒pGL-FOXP3promptor-reporter-FOXP3 enhancer的构建方法，其特征在于：1)将目的基因扩增；2)将载体酶切并与多目的片段同源重组；3)所得连接产物转化感受态细胞；4)涂板后菌落PCR鉴定并将提取质粒测序。
7.权利要求1-3中任一项所述的细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告重组质粒pGL-FOXP3promptor-reporter-FOXP3 enhancer的构建方法，其特征在于：报告基因的表达水平由人FOXP3启动子和增强子共同控制，报告基因的水平反映内源性调控FOXP3的水平，可应用于机体炎症、自身免疫疾病中Treg细胞免疫功能水平的检测。
8.权利要求1-3中任一项所述的细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告重组质粒pGL-FOXP3 promptor-reporter-FOXP3 enhancer能够有效用于细胞系人CD4+T细胞Jurkat细胞中表达的研究。
9.权利要求1-3中任一项所述的细胞系人源FOXP3表达水平的重组报告重组质粒pGL-FOXP3 promptor-reporter-FOXP3 enhancer用于人源FOXP3表达水平的检测以及药物筛选系统构建的方法，其特征在于：以人胚肾上皮细胞293细胞家族为筛选细胞，通过佛波酯(PMA)刺激构建FOXP3升高的293细胞模型，用于筛选降低FOXP3表达的药物；通过人TNF-α刺激构建FOXP3降低的293细胞模型，用于筛选升高FOXP3表达的药物。
10.权利要求9所述的检测以及药物筛选系统构建的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)以DMEM完全培养基重悬293细胞，并接种于孔板中；2)待细胞汇合度达到60-80％时，按照Lipofectamin 3000转染说明书进行转染FOXP3-报告质粒；加入待筛选药物后放入细胞培养箱1-3h后，加入PMA或者TNF-α刺激12-36h；3)G250法测量蛋白浓度并检测发光值或者直接荧光显微镜拍照。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测细胞系人源foxp3表达水平的重组报告质粒pgl-foxp3promptor-reporter-foxp3 enhancer，其特征在于：分别由抗性基因、人foxp3启动子、报告基因、人foxp3增强子构成。
2.权利要求1所述的用于检测细胞系人源foxp3表达水平的重组报告质粒pgl-foxp3promptor-reporter-foxp3 enhancer，其特征在于：所含的抗性基因为氨苄霉素抗性基因。
3.权利要求1所述的用于检测细胞系人源foxp3表达水平的重组报告质粒pgl-foxp3promptor-reporter-foxp3 enhancer，其特征在于：所述的人foxp3启动子为人foxp3基因eukaryotic promoter database(epd)-501-+186碱基区域，序列如序列1“seq_1”所示。
4.权利要求1所述的用于检测细胞系人源foxp3表达水平的重组报告质粒pgl-foxp3promptor-reporter-foxp3 enhancer，其特征在于：所述的人foxp3增强子为人foxp3基因1800-1922碱基区域，序列如序列2“seq_2”所示。
5.权利要求1所述的用于检测细胞系人源foxp3表达水平的重组报告质粒pgl-foxp3promptor-reporter-foxp3 enhancer，其特征在于：所述的报告基因可以是荧光素酶或者荧光蛋白：绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、dsredexpress2、mcherry、morange、mplum黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(ecfp)、以及sapphire。
6.权利要求1-3中任一项所述的细胞系人源foxp3表达水平的重组报告重组质粒pgl-foxp3promptor-reporter-foxp3...
【专利技术属性】
技术研发人员：林明宝，侯琦，李萍，张梓倩，文鑫祝，方楠，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：
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