【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及一种具有抗老化功效的工程化仿生外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、外泌体，是一种由大多数细胞分泌而来的纳米级小膜泡（30-100nm），具有磷脂双分子结构，内含dna、rna、蛋白质等物质及大量活性成分。它主要参与细胞间通讯和物质运输，是天然的纳米载体结构。外泌体作为一种新兴的纳米载体，能穿透细胞间隙，靶向至目标作用部位。然而，外泌体在活性物递送应用中，仍存在许多问题未能有效解决，如细胞来源多样风险未知、提纯获取难度大、保存条件苛刻（-18℃以下）、携带遗传物质、负载能力弱等。
2、茶多酚，是茶叶中多酚类物质的总称，其中以黄烷醇类物质（儿茶素）最为重要，约占多酚类总量的60%-80%；儿茶素类主要由egc、dlc、ec、egcg、gcg、ecg等几种单体组成。表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）具有优越的抗氧化作用，其清除活性自由基能力显著高于维生素c和维生素e，可被用作抗氧化和抗老化功效成分。然而，由于egcg极性较大，且分子结构中含有多个酚羟基，因此egcg在化妆品中实际应用时，多存在稳定性差和透皮吸收性生物利用率低等问题，导致其生物利用度低。为改善egcg的稳定性和经皮渗透性，现有技术中多采用纳米载体对egcg进行包裹处理，但仍存在透皮吸收度极低，无法有效穿透皮肤角质层发挥其功效的问题。
3、线粒体功能的衰退被认为是衰老机制中的重要环节。随着年龄的增长，线粒体的功能逐渐下降，表现为能量产生减少、氧化应激增加等。这些变化导致细胞功能下降，进而引发组织器官的功能衰退
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术中，本专利技术的首要目的在于提供一种具有抗老化功效的工程化仿生外泌体的制备方法。
2、本专利技术另一目的在于提供上述方法制备得到的具有抗老化功效的工程化仿生外泌体。
3、本专利技术还提供上述方法制备的具有抗老化功效的工程化仿生外泌体的应用。
4、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
5、本专利技术具有抗老化功效的工程化仿生外泌体经两步形成，首先制备仿生细胞膜改性靶向配体；然后再通过外泌体工程化仿生包载活性物质（egcg）形成。所述仿生细胞膜改性靶向配体，由线粒体靶向多肽改性胶原蛋白得到。
6、具体地，一种具有抗老化功效的工程化仿生外泌体的制备方法，包括如下步骤：
7、（s1）制备仿生细胞膜改性靶向配体：将胶原蛋白、线粒体靶向多肽、缩合剂、4-二甲氨基吡啶加入至有机溶剂中，在保护气氛下活化，之后将赖氨酸加入上述体系中反应，得到仿生细胞膜改性靶向配体；
8、（s2）通过将仿生细胞膜改性靶向配体嵌入工程化外泌体仿生膜中，并包载活性物质形成工程化仿生外泌体。
9、优选地，（s1）反应结束后，还包括纯化步骤：将反应混合物转移至透析袋中（截留分子量为1500-12000 da），在去离子水中透析48-96h，以除去未反应的胶原蛋白、精氨酸和活性多肽原料，每隔6h更换一次去离子水。透析袋内液体经高速离心（8000-10000 rpm）10-30min，取上清液经冷冻干燥24-48h，可得精制的仿生细胞膜改性靶向配体。
10、优选地，s1中所述活化条件为：-10-10℃条件下活化1-3h；所述反应条件为：于25-50℃条件下反应24-72h。
11、优选地，所述的线粒体靶向多肽为谷胱甘肽（glu-cys-gly，gsh）、赖氨酸-亮氨酸-丙氨酸三肽（lys-leu-ala，lla）、六肽-2（gly-arg-ala-asp-ser-pro，gaaasp）和ss肽（cys-d-arg-dmt-lys-phe-nh2，cadlp）、ss-31肽(d-arg-dimethyltyr-lys-phe-nh2)中的至少一种；所述胶原蛋白的分子量为3000 da -150000da。
12、优选地，所述胶原蛋白的分子量为50000da -100000da；所述胶原蛋白和线粒体靶向多肽的摩尔比为1：0.5-2.5；所述胶原蛋白和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：0.5-2.5；所述胶原蛋白和赖氨酸的摩尔比为1：0.1-1.0。
13、优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺（dcc）、二异丙基碳二亚胺（dic）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（edc）中的至少一种；所述胶原蛋白和缩合剂的摩尔比为1：0.5-2.5；
14、所述有机溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种；所述胶原蛋白和有机溶剂的质量比为1：5-100。
15、优选地，所述具有抗老化功效的工程化仿生外泌体的制备，包括如下步骤：
16、（1）将磷脂、仿生细胞膜改性靶向配体、仿生细胞膜稳定剂加入到多元醇溶剂中，搅拌均匀，获得醇相；
17、（2）将活性物质加入至酵母菌/木醋杆菌/红茶发酵产物中，搅拌均匀，获得水相；
18、（3）将所述水相匀速滴加至醇相中，滴加完成后，继续搅拌，获得混合溶液；
19、（4）混合溶液经滤膜挤压处理，获得工程化仿生外泌体；
20、所述仿生细胞膜改性靶向配体的添加量为外泌体重量的0.02%-0.30%。
21、优选地，以质量百分数计，磷脂为2-5%；仿生细胞膜改性靶向配体为0.1%-0.2%；仿生细胞膜稳定剂为0.1-0.3%；多元醇溶剂为10-30%；活性物质为1-7%；酵母菌/木醋杆菌/红茶发酵产物为57.5-86.8%；所述活性物质为茶多酚。
22、优选地，所述茶多酚包括表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg），表儿茶素（ec）、没食子酸儿茶素（gc），儿茶素没食子酸酯（cg）和表没食子酸儿茶素（egc）中的一种或两种以上。
23、优选地，步骤（1）中所述磷脂为大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、酶解卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和蛋黄卵磷脂中的至少一种。
24、优选地，所述仿生细胞膜稳定剂为胆固醇、胆酸钠中的至少一种。
25、优选地，所述的多元醇溶剂为1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、甘油、1,2-己二醇、乙氧基二甘醇中的至少一种。所述溶剂具有绿色安全、无毒、皮肤刺激性低的特征，避免引起皮肤敏感应激反应。
26、优选地，步骤（1）中所述的搅拌温度为25-60℃；搅拌速度为100-500rpm；搅拌时间为0.5-6h。
27、优选地，步骤（2）中所述的搅拌温度为25-60℃；搅拌速度为100-500rpm；搅拌时间为10-20min。
28、优选地，步骤（3）中所述滴加速度为2-10 ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有抗老化功效的工程化仿生外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的线粒体靶向多肽为谷胱甘肽、赖氨酸-亮氨酸-丙氨酸三肽、六肽-2、SS肽和SS-31肽中的至少一种；所述胶原蛋白的分子量为3000 Da -150000Da。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白的分子量为50000Da -100000Da；所述胶原蛋白和线粒体靶向多肽的摩尔比为1：0.5-2.5；所述胶原蛋白和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：0.5-2.5；所述胶原蛋白和赖氨酸的摩尔比为1：0.1-1.0。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺中的至少一种；所述胶原蛋白和缩合剂的摩尔比为1：0.5-2.5；
5.根据权利要求1~4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述仿生细胞膜改性靶向配体的添加量为外泌体重量的0.02%-0.30%。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）（3）的搅拌条件为转速300±150 rpm，时间3±1h；步骤（2）的搅拌条件为转速300±100 rpm，时间30±20min；步骤（3）滴加速度为5±3 ml/min；步骤（4）挤压处理的条件为压力4.0±2.0MPa，处理20±5min；
9.权利要求1~8任一项所述方法制得的具有抗老化功效的工程化仿生外泌体。
10.权利要求9所述具有抗老化功效的工程化仿生外泌体在化妆品中的应用，或在制备皮肤外用药中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种具有抗老化功效的工程化仿生外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的线粒体靶向多肽为谷胱甘肽、赖氨酸-亮氨酸-丙氨酸三肽、六肽-2、ss肽和ss-31肽中的至少一种；所述胶原蛋白的分子量为3000 da -150000da。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白的分子量为50000da -100000da；所述胶原蛋白和线粒体靶向多肽的摩尔比为1：0.5-2.5；所述胶原蛋白和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：0.5-2.5；所述胶原蛋白和赖氨酸的摩尔比为1：0.1-1.0。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺中的至少一种；所述胶原蛋白和缩合剂的摩尔比为1：0.5-2.5；
5.根据权利要求1~4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述仿生细胞膜改性靶向配体的添加量为...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭卫华，黄泽婷，温伟球，周心慧，梁嘉慧，胡文臻，王冠海，
申请(专利权)人：广东粤港澳大湾区黄埔材料研究院，
类型：发明
国别省市：
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