【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及一种微生物全细胞高效制备维库溴胺还原物的方法。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、维库溴胺(vecuronium bromide)，化学名称3-[17β-acetoxy-3α,17α-dihydroxy-2β-(4-morpholinyl)-5α-androstan-16β-yl]-1-(2-propeny l)-pyrrolidiniumbromide，分子式c34h57brn2o4，分子量637.75，是一种常用的非去极化肌肉松弛剂，作用于神经肌肉接头，通过竞争性拮抗乙酰胆碱在烟碱型胆碱受体上的结合，阻断神经冲动传递，导致骨骼肌松弛。临床中用于外科手术时的肌肉松弛，辅助全身麻醉；插管操作中辅助气管插管以确保呼吸道开放；重症监护时在需要长时间机械通气时，用于肌肉松弛。与其他非去极化肌松药(如筒箭毒碱)相比，维库溴胺起效快、作用时间适中，且副作用较少。无明显的心血管副作用，不引起组胺释放，因此较安全。维库溴胺主要通过肝脏代谢，并经胆道和尿液排泄。其代谢产物具有一定活性，但活性较低。维库溴胺以其较高的安全性、可控性和适中的作用时间，成为现代麻醉过程中广泛使用的肌松药之一。
2、维库溴胺还原物属于羟基化合物，是制备维库溴胺的中间体，化学名称为2β,16β-二哌啶-5α-雄甾-3α,17β-二醇，cas13522-16-2。现有方法中，采用羰基还原酶转化维库溴胺双胺物(化学名称为2β,16β-二哌啶-5α-雄甾-3α-醇-17-酮，cas13522-14-0)制备维库溴胺还原物，反应机理如图
3、羰基还原酶广泛存在于微生物细胞中，是一种胞内酶，可以催化羰基化合物还原制备羟基化合物。采用羰基还原酶转化羰基化合物的反应过程中需要辅酶nad(p)h作为供氢体，以葡萄糖作为辅助底物实现辅酶nad(p)h的再生。
4、相比羰基还原酶，微生物全细胞转化羰基化合物具有显著的优点，比如操作简便、成本较低、无需分离纯化酶、催化体系稳定、细胞内酶受细胞膜保护而耐受性较强、减少额外辅酶需求，无需外加昂贵的辅酶再生系统。全细胞催化大多数微生物催化反应在中性ph和常温常压下进行，避免了化学催化常需高温高压和强酸强碱条件及常见的副反应，不仅反应条件温和，而且具有高催化活性、选择性，提高了产物纯度。此外，微生物全细胞具有天然的代谢通路，可以同时完成多步反应，避免中间产物的分离提纯，催化过程通常使用水作为溶剂，不涉及有毒有害化学试剂，减少环境污染，绿色环保。微生物可以通过培养快速增殖，属于可再生的催化剂来源，与化学催化剂相比更具可持续性。微生物全细胞催化通过综合利用细胞内的酶系统和代谢功能，在羰基化合物转化中展现了显著的优势，尤其在制备手性化合物和实现复杂多步反应方面，正逐渐成为绿色化学和生物催化领域的重要发展方向。
5、因此，需要寻找一种利用微生物高效合成维库溴胺中间体的方法。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种微生物全细胞高效制备维库溴胺还原物的方法，本专利技术首先筛选高产羰基还原酶的微生物；再选择合适的反应体系，以微生物全细胞为生物催化剂，转化维库溴胺双胺物制备维库溴胺还原物，不仅反应条件温和，产物分离提取简单，而且生物转化率较高，有助于大规模制备维库溴胺还原物，为维库溴胺的制备提供新途径。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种微生物全细胞高效制备维库溴胺还原物的方法，所述方法包括如下步骤：以产羰基还原酶的热带假丝酵母(candida tropicalis)经发酵培养获得的含生长细胞的发酵液或发酵液离心得到的湿菌体静息细胞为催化剂，以维库溴胺双胺物为底物，羟乙基-β-环糊精为助溶剂，以ph6～10.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～40℃(优选35℃)、100-180r/min(优选160r/min)的摇床中反应完全(优选反应48-120h，更优选96h)，将反应液分离纯化，获得所述的维库溴胺还原物。
4、进一步，所述产羰基还原酶的热带假丝酵母为热带假丝酵母cgmcc no.15016。
5、进一步，所述转化体系中催化剂用量以湿菌体重量计，加入量为60-120g/l(优选120g/l)；底物投料量为30-100g/l(优选50-80g/l)，羟乙基-β-环糊精投料量为1-20g/l(优选6g/l)。
6、进一步，当催化剂为湿菌体静息细胞时，反应体系中添加10-100g/l葡萄糖，优选50g/l。
7、进一步，反应介质为ph8.0、0.2mm的磷酸钠缓冲液。
8、进一步，催化剂按如下方法制备：1)将热带假丝酵母(优选candida tropicaliscgmcc no.15016)接种到斜面培养基中，于30℃培养3-5天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：葡萄糖20g/l，硫酸铵1g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，氯化钠1g/l，硫酸镁0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；2)将斜面上的菌体接种入装液25ml种子培养基的100ml三角瓶中，30℃，120r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：葡萄糖46g/l，酵母汁25g/l，磷酸二氢钾4g/l，磷酸氢二钾4g/l，氯化钠0.1g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；3)将种子液以体积浓度10％的接种量接入装液250ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，30℃，120r/min培养24h，获得含生长细胞的发酵液；发酵液于8000r/min的离心机中离心20分钟，弃去上清液，沉淀用ph8.0、0.2mm的磷酸钠缓冲液反复洗涤3次，获得湿菌体静息细胞；发酵培养基组成：葡萄糖46g/l，酵母汁25g/l，磷酸二氢钾4g/l，磷酸氢二钾4g/l，氯化钠0.1g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
9、进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液10000r/min离心10min，沉淀采用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层旋转蒸发至干，获得维库溴胺还原物。
10、本专利技术产羰基还原酶的热带假丝酵母(candida tropicalis)zjutss412，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号cgmcc no.15016，保藏日期2017年12月4日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，已在专利申请zl201810696272.8中公开。
11、与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：
12、(1)本专利技术筛选的热带假丝酵母cgmcc no.15016能够以含生长细胞的发酵液或发酵液离心后的湿菌体静息细胞为催化剂高效催化维库溴胺双胺物制备维库溴胺的中间体维库溴胺还原物，其中发酵液能够直接进行转化反应，湿菌体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物全细胞高效制备维库溴胺还原物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以产羰基还原酶的热带假丝酵母经发酵培养获得的含生长细胞的发酵液或发酵液离心得到的湿菌体静息细胞为催化剂，以维库溴胺双胺物为底物，羟乙基-β-环糊精为助溶剂，以pH6～10.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～40℃、100-180r/min的摇床中反应完全，将反应液分离纯化，获得所述的维库溴胺还原物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产羰基还原酶的热带假丝酵母为热带假丝酵母CGMCC No.15016。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化体系中催化剂用量以湿菌体重量计，加入量为60-120g/L；底物投料量为30-100g/L，羟乙基-β-环糊精投料量为1-20g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当催化剂为湿菌体静息细胞时，反应体系中添加10-100g/L葡萄糖。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应介质为pH8.0、0.2mM的磷酸钠缓冲液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种微生物全细胞高效制备维库溴胺还原物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以产羰基还原酶的热带假丝酵母经发酵培养获得的含生长细胞的发酵液或发酵液离心得到的湿菌体静息细胞为催化剂，以维库溴胺双胺物为底物，羟乙基-β-环糊精为助溶剂，以ph6～10.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～40℃、100-180r/min的摇床中反应完全，将反应液分离纯化，获得所述的维库溴胺还原物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产羰基还原酶的热带假丝酵母为热带假丝酵母cgmcc no....
【专利技术属性】
技术研发人员：陈益俊，刘风强，邹义勇，王乐晓，欧志敏，
申请(专利权)人：台州仙琚药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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