【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，特别涉及一种鉴别圆端蚕蛾性别的特异性dna片段、引物组、试剂盒、检测试剂及应用。
技术介绍
1、圆端蚕蛾(rotunda rotundapex)为蚕蛾科(bombycidae)蚕蛾族(bombycini)圆端蚕蛾属(rotunda)昆虫。因该类昆虫的前后翅类似、呈近圆形而命名，是与家蚕(bombyxmori)和野蚕(bombyx mandarina)关系最密切的物种，其茧色茧形非常接近。miyata和kishida(1990年)首次采集并描述了这种昆虫，根据翅纹元素和雄性外生殖器的特征，将其归入bombyx属。王林瑶(1998)以“我国新记录——蚬蛾科”为题，报道了在中国首次发现“蚬蛾科”昆虫。文中提到他在整理蚕蛾科标本的过程中发现来自于四川灌县等地的标本与蚕蛾有明显区别，并将这些标本鉴定为蒲公英蚬蛾lemonia taraci，分布于四川、福建和湖北，并绘制了雄性外生殖器和翅脉等特征图。之后圆端蚕蛾的分类地位一直饱受争议，有学术观点认为此物种为蚬蛾科昆虫，中国不存在圆端蚕蛾。
2、直至2015年，wang等人通过圆形翅、雄性生殖器狭窄且分叉的阴茎头以及成熟幼虫第八腹节上没有小角来区分该属，建立了包含r.rotundapex这一物种单独的rotunda属。详细描述如下：雄性外生殖器爪形突瓶颈状，顶端略膨大，分叉，叉端部圆钝；背究不发达；颚形突弱骨化；抱器细长；囊形突粗短，端部圆端；阳莲粗短，端部具角状突起。虫体光滑，各节无明显突起；成虫前后翅的顶角、臀角圆钝，翅脉近外缘有短小横脉相互相连，呈
3、2017年，崔乐重新检视王林瑶的定名标本，发现这些标本的形态特征不符合蚬蛾科的特征，而与蚕蛾科(bombycidae)圆端蚕蛾属(rotunda)的特征一致，并将错误鉴定进行了订正，重新描述了误订标本的形态特征。同时提供了成虫、翅脉和外生殖器照片，并对圆端蚕蛾r.rotundapex与蒲公英蚬蛾l.taraci的主要特征进行了比较分析，取消了蚬蛾科在中国的分布记录。
4、圆端蚕蛾具有重要的经济价值和生态价值，是我国桑蚕种质资源的重要组成部分，研究圆端蚕蛾对于研究昆虫的进化、生态和生理有重要的意义，是应该被保护的重要物种之一。圆端蚕蛾形态特征与家蚕和野蚕相似，以至于人们长期以来忽略其物种存在情况，以至于关于圆端蚕蛾种质多样性和种群遗传学的研究报道相对较少见。为了该物种资源的合理开发及可持续利用，对其野生群体的遗传多样性开展研究十分必要。
5、鳞翅目昆虫性染色体在昆虫界独树一帜，其性染色体以zz/zw系统为主，其中雄性为zz，雌性为zw。1916年，日本学者首次在家蚕中发现w染色体。然而，该染色体序列一直没有被破译。家蚕基因组研究经历了20余年，完成种质资源“千蚕基因组计划”，发布世界首张“家蚕超级泛基因组图谱”，率先创建“数字家蚕”基因库，然而对性别起决定性作用的w染色体的序列从未发布。直到2024年才破译，说明了研究的难度。w染色体的标记，除了对于性别鉴定有用外，对于w染色体的测序也意义非凡，可以用于设计圆端蚕蛾w染色体的特异探针，标记该染色体。而且该片段的同源片段在家蚕中位于2号染色体，这说明w染色体的组成是十分复杂的，这对于研究w染色体的进化也具有重要用途。
6、圆端蚕蛾作为一个新发现的昆虫，目前对圆端蚕蛾的研究仅见形态、饲养等记述，其基因组数据目前在ncbi只有20条，而且没有一条核基因的信息。昆虫(农业害虫和益虫)的性别鉴定对于害虫的有效防治和益虫的有效保护具有重要意义。虽然圆端蚕蛾作为鳞翅目昆虫，其不同性别的虫体在蛹期和成虫形态上存在差异，但现有的人工区分方式具有费时费力、不能规模化实施的缺陷，且圆端蚕蛾幼虫的形态往往接近，性别更难以鉴别。
技术实现思路
1、基于以上技术问题，本专利技术利用成虫雌雄差异鉴定雌雄，对圆端蚕蛾不同性别个体进行ngs测序，利用仅仅在雌性测序数据中有的片段设计引物，进行pcr筛选，获得了一个雌特异片段。进一步设计该片段的引物，通过pcr结合琼脂糖凝胶电泳的方法，能够准确鉴定圆端蚕蛾的雌雄。
2、本专利技术提供的具体技术方案如下：
3、本专利技术第一方面，提供一种鉴别圆端蚕蛾性别的特异性dna片段，所述特异性dna片段的核苷酸序列如seq id no.48所示。
4、本专利技术第二方面，提供一种用于扩增所述特异性dna片段的引物组，所述引物组包括上游引物及下游引物；
5、上游引物w20f：5'-tcacactatagcagactgttgac-3'；
6、下游引物w20r：5'-tttgggtagggagggttacga-3'。
7、本专利技术第三方面，提供一种试剂盒，其包括所述引物组。
8、本专利技术第四方面，提供一种检测试剂，其包括所述引物组。
9、本专利技术第五方面，提供一种所述特异性dna片段、所述引物组、所述试剂盒或所述检测试剂在鉴别圆端蚕蛾性别中的用途。
10、本专利技术第六方面，提供一种鉴别圆端蚕蛾性别的方法，包括以下步骤；
11、提取待测样品的全基因组dna；
12、以所述全基因组dna为模板，利用所述引物组进行pcr扩增；
13、凝胶电泳法检测扩增产物，在870bp处出现特异性条带，则判定为雌性个体；在870bp处未出现特异性条带，则判定为雄性个体。
14、作为本专利技术的一个优选实施例，pcr扩增反应程序为：94℃预变性3～5min；94℃变性30～45s，52～56℃退火30～60s，72℃延伸60s，35循环；72℃终延伸7～10min。
15、更优选地，pcr扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火35s，72℃延伸60s，35循环；72℃终延伸7min。
16、作为本专利技术的一个优选实施例，pcr扩增反应体系为：1μl dna模板、0.5μl10nmol/l的w20f引物、0.5μl 10nmol/l的w20r引物、12.5ul 2×easytaq pcr supermix及10.5μl h2o。
17、本专利技术第七方面，提供一种所述特异性dna片段或所述引物组或所述试剂盒或所述检测试剂在圆端蚕蛾育种中的用途。
18、对比现有技术，本专利技术的有益效果为：
19、本专利技术对不同性别的圆端蚕蛾个体进行ngs(next generation sequencing)测序，利用仅仅在雌性中有的片段设计引物，进行pcr筛选，获得了一个雌特异的片段。进一步设计位于w染色体的该特异片段的引物，通过pcr结合琼脂糖凝胶电泳的方法，能够准确的鉴定圆端蚕蛾的雌雄，解决了圆端蚕蛾幼虫性别特征不明显，不能有效区分的难题。对于圆端蚕蛾的性别控制育种、野生资源保护和养殖产业的发展提供帮助。
20、本专利技术提供的鉴别方法中，包括一对性别特异性分子标记引物(w染色体特异)和一对内参基因引物(线粒体基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴别圆端蚕蛾性别的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示。
2.一种用于扩增所述特异性DNA片段的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物及下游引物；
3.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2所述引物组。
4.一种检测试剂，其特征在于，其包括权利要求2所述引物组。
5.一种权利要求1所述特异性DNA片段或权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂盒或权利要求4所述检测试剂在鉴别圆端蚕蛾性别中的用途。
6.一种鉴别圆端蚕蛾性别的方法，其特征在于，包括以下步骤；
7.根据权利要求6所述的鉴别圆端蚕蛾性别的方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3～5min；94℃变性30～45s，52～56℃退火30～60s，72℃延伸60s，35循环；72℃终延伸7～10min。
8.根据权利要求6所述的鉴别圆端蚕蛾性别的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：1μl DNA模板、0.5μl 10nmol/L的W20f引物、0.5μl 1
9.一种权利要求1所述特异性DNA片段或权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂盒或权利要求4所述检测试剂在圆端蚕蛾育种中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴别圆端蚕蛾性别的特异性dna片段，其特征在于，所述特异性dna片段的核苷酸序列如seq id no.48所示。
2.一种用于扩增所述特异性dna片段的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物及下游引物；
3.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2所述引物组。
4.一种检测试剂，其特征在于，其包括权利要求2所述引物组。
5.一种权利要求1所述特异性dna片段或权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂盒或权利要求4所述检测试剂在鉴别圆端蚕蛾性别中的用途。
6.一种鉴别圆端蚕蛾性别的方法，其特征在于，包括以下步骤；
7.根据权利要求6所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔卫青，杨金宏，何雨，常倩怡，彭云武，
申请(专利权)人：安康学院，
类型：发明
国别省市：
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