【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肌酐酶生产，具体涉及一种突变基因、重组蛋白、质粒、重组菌及制备方法和应用。
技术介绍
1、肌酐是人体肌肉中的磷酸肌酸通过自发的且不可逆转的代谢过程形成的，在肾脏功能正常情况下，肌酐在血液中的浓度维持在一个较低的水平，而在肾脏功能不全时，会导致肌酐在血清中的积累。因此，血清中肌酐含量是反映肾脏功能的重要指标。对于肌酐的检测，应用最为广泛的是碱性苦味酸法，但存在着反应特异性差与灵敏度有限的问题，目前正逐渐被酶法(肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法)检测所替代，其中肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶是三个关键性的酶，肌酐酶可逆地水解肌酐生成肌酸，肌酸酶催化肌酸水解产生肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶作用下水解生成甲醛、甘氨酸和h2o2，偶联trinder氏反应，通过比色测定，计算出样品中肌酐的含量。酶法具有抗干扰能力强、特异性好、线性范围宽、灵敏度高等特点，商品化的试剂盒大多采用肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法，并且在临床上得到了越来越多的使用。
2、肌酐酶是用于酶法检测肌酐试剂盒中的关键检测工具酶，但酶法试剂盒中的关键工具酶目前还主要依赖进口产品，国产酶原料发酵产量较低且技术稳定性不佳，致使肌酐检测试剂盒生产成本一直处于较高水平。为了降低生产销售成本和减轻患者检测负担，制备生产活性高的肌酐酶生产菌株，提高肌酐酶表达量和酶活性，对推动其在肌酐检测试剂盒中的广泛应用尤其重要。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种突变基因、重组蛋白、质粒、重组菌及制备方法和应用
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面，提供一种突变基因，所述的突变基因与genbank编号为af170566.3的cah序列的cds区别在于，第323碱基位置发生g→c突变，突变后基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。
4、本专利技术的第二方面，提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白由权利要求1所述的突变基因表达而成，与由genbank编号为af170566.3的cah序列表达而成的蛋白的区别在于，第108位氨基酸由精氨酸突变为脯氨酸，突变后蛋白的氨基酸序列如seq id no:4所示。
5、本专利技术的第三方面，提供一种质粒，所述的质粒包括所述的突变基因。
6、本专利技术的第四方面，提供一种重组菌，所述的重组菌包括所述的突变基因或所述的质粒。
7、本专利技术的第五方面，提供所述的重组菌的制备方法，包括以下步骤：
8、(1) 将cah基因序列进行序列优化、基因活性位点突变，然后插入初始质粒中得到重组质粒；
9、(2)将重组质粒转化至大肠杆菌内即可得到重组菌。
10、进一步的，步骤(1)包括以下过程：
11、将 pseudomonas putida来源的cah序列进行序列优化，并识别酶活性基因位点，对活性位点进行基因突变得到优化后基因；扩增优化后基因序列，引入bamhi和xhoⅰ酶切位点，得到扩增后的cah片段；用bamhi和xhoⅰ酶分别对初始质粒和扩增后的cah片段进行双酶切，消化、纯化后，分别可得到连接载体产物和位点突变cah片段产物；将载体产物和位点突变cah片段产物连接，构建得到重组质粒。
12、进一步的，所述的初始质粒为pet-28a(+)；所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。
13、在本专利技术一些实施例中，将密码子和基因位点突变优化后的cah序列插入质粒pet-28a(+)的bamhi和xhoⅰ之间。
14、进一步的，步骤(2)中，采用热激法进行转化。
15、本专利技术的第六方面，提供所述的重组菌在制备重组肌酐酶中的应用。
16、进一步的，将重组菌在发酵培养基中培养，添加诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷进行诱导培养，待培养结束后离心收集菌体，经裂解、纯化得到重组肌酐酶；诱导培养的条件为25-35℃、0.1-1mm iptg诱导6-18h；纯化的方式为两步纯化，先用ni-nta进行纯化，再用离子交换色谱进行纯化。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术将密码子优化和基因位点突变后的肌酐酶基因通过重组质粒导入感受态大肠杆菌中，构建重组菌株，其制备方法简便。本专利技术提供的大肠杆菌重组菌株，能高效表达重组肌酐酶，且通过两步亲和纯化即可获得高纯度的重组肌酐酶，极大提高了肌酐酶的产量，并降低了酶原料的制备成本，定点突变组的酶比活相对未突变组的酶比活提升至130.3%，具有广阔的应用前景。
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1.一种突变基因，其特征在于，所述的突变基因与GenBank编号为AF170566.3的cah序列的CDS区别在于，第323碱基位置发生G→C突变，突变后基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白由权利要求1所述的突变基因表达而成，与由GenBank编号为AF170566.3的cah序列表达而成的蛋白的区别在于，第108位氨基酸由精氨酸突变为脯氨酸，突变后蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种质粒，其特征在于，所述的质粒包括权利要求1所述的突变基因。
4.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌包括权利要求1所述的突变基因或权利要求3所述的质粒。
5.权利要求4所述的重组菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的重组菌的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下过程：
7.根据权利要求6所述的重组菌的制备方法，其特征在于，所述的初始质粒为pET-28a(+)；所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.根据
9.权利要求4所述的重组菌在制备重组肌酐酶中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将重组菌在发酵培养基中培养，添加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导培养，待培养结束后离心收集菌体，经裂解、纯化得到重组肌酐酶；诱导培养的条件为25-35℃、0.1-1mM IPTG诱导6-18h；纯化的方式为两步纯化，先用Ni-NTA进行纯化，再用离子交换色谱进行纯化。
...【技术特征摘要】
1.一种突变基因，其特征在于，所述的突变基因与genbank编号为af170566.3的cah序列的cds区别在于，第323碱基位置发生g→c突变，突变后基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。
2.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白由权利要求1所述的突变基因表达而成，与由genbank编号为af170566.3的cah序列表达而成的蛋白的区别在于，第108位氨基酸由精氨酸突变为脯氨酸，突变后蛋白的氨基酸序列如seq id no:4所示。
3.一种质粒，其特征在于，所述的质粒包括权利要求1所述的突变基因。
4.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌包括权利要求1所述的突变基因或权利要求3所述的质粒。
5.权利要求4所述的重组菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【专利技术属性】
技术研发人员：卢志明，成士清，童书青，刘美辰，段佳志，董雯，
申请(专利权)人：山东第一医科大学附属省立医院山东省立医院，
类型：发明
国别省市：
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