【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫检测，尤其是指一株分泌哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
1、哌醋甲酯的英文通用名为methylphenidate，是一种中枢神经兴奋药物，主要用于治疗儿童等注意缺陷多动障碍、发作性睡病等。可以提高注意力，让孩子的精神集中，一定程度上提高学习能力。但是，长期服用具有成瘾性，属于国家严格管制的一类精神药品，因此只能在医院凭医生的处方调配，并根据患者的病理生理情况和疗程限量供应。但有些机构、家长或者非法分子利用哌醋甲酯药物特性，非法获取哌醋甲酯，极大的威胁了社会法制安全，因此对哌醋甲酯进行高灵敏检测非常重要。
2、目前，哌醋甲酯检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简便的检测哌醋甲酯残留物的方法。
3、酶联免疫吸附试验(elisa)是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在药物残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测哌醋甲酯的前提是得到对哌醋甲酯具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对哌醋甲酯具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。专利技术人尝试通过杂交瘤细胞制备哌醋甲酯单克隆抗体，但在制备能分泌哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备哌醋甲酯半抗
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一株分泌哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的哌醋甲酯单克隆抗体对哌醋甲酯具有较好的检测灵敏度(ic50值为1.02ng/ml)，可以用于建立哌醋甲酯的免疫学检测方法，检测尿液中哌醋甲酯的残留。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的第一个目的是提供一株分泌哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2024年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.46223，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为单克隆细胞株。
4、本专利技术的第二个目的是提供一种哌醋甲酯单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
5、本专利技术的第三个目的是提供一种哌醋甲酯半抗原，用于制备所述的杂交瘤细胞株，所述哌醋甲酯半抗原的结构式为：
6、
7、本专利技术的第四个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的哌醋甲酯单克隆抗体。
8、本专利技术的第五个目的是提供一种检测哌醋甲酯的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的哌醋甲酯单克隆抗体和所述的组合物中的至少一种。
9、在本专利技术的一个实施例中，所述试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
10、本专利技术的第六个目的是提供一种检测哌醋甲酯的试纸条，所述试纸条含有所述的杂交瘤细胞株、所述的哌醋甲酯单克隆抗体和所述的组合物中的至少一种。
11、在本专利技术的一个实施例中，所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述结合垫上包被所述哌醋甲酯单克隆抗体。
12、本专利技术的第七个目的是提供一种检测哌醋甲酯的芯片，所述芯片含有所述杂交瘤细胞株、所述的哌醋甲酯单克隆抗体和所述的组合物中的至少一种。
13、本专利技术的第八个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的哌醋甲酯单克隆抗体、所述的组合物、所述的试剂盒、所述的试纸条或所述的芯片在检测哌醋甲酯中的应用。
14、本专利技术提供了所述分泌哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：
15、步骤1：制备哌醋甲酯半抗原及哌醋甲酯完全抗原，将获得的哌醋甲酯完全抗原与弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化，制备成免疫原；
16、步骤2：将得到的免疫原通过背部皮下注射，注射进入balb/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
17、步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接elisa检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中哌醋甲酯抗体灵敏度高的小鼠；
18、步骤4：将筛选出的小鼠通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的哌醋甲酯完全抗原；
19、步骤5：将冲刺免疫后的balb/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，融合后的细胞通过hat培养基筛选培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌高灵敏度哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
20、在本专利技术的一个实施例中，步骤1中，所述哌醋甲酯半抗原的分子式如下：
21、
22、在本专利技术的一个实施例中，步骤1中，所述哌醋甲酯完全抗原的分子式如下：
23、
24、在本专利技术的一个实施例中，所述哌醋甲酯完全抗原的制备方法为将哌醋甲酯半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解于无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌反应，得到活化的哌醋甲酯半抗原溶液，即a液；将钥孔血蓝蛋白用碳酸盐缓冲溶液(cbs)稀释，得到b液；将a液缓慢加入到b液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液(pbs)透析反应液，得到完全抗原。
25、在本专利技术的一个实施例中，步骤2、4中，所述首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。
26、在本专利技术的一个实施例中，步骤2、4中，所述首次免疫剂量为20μg/只～100μg/只，加强免疫剂量为10μg/只～50μg/只，冲刺免疫剂量为5μg/只～25μg/只。优选地，首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
27、在本专利技术的一个实施例中，步骤2、4中，所述免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；
28、在本专利技术的一个实施例中，步骤3中，所述采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
29、在本专利技术的一个实施例中，步骤5中，所述细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
30、在本专利技术的一个实施例中，步骤5中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(peg4000)法进行的。
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1.一株分泌哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2024年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.46223，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为单克隆细胞株。
2.一种哌醋甲酯单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种哌醋甲酯半抗原，用于制备权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述哌醋甲酯半抗原的结构式为：
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株和/或权利要求2所述的哌醋甲酯单克隆抗体。
5.一种检测哌醋甲酯的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求2所述的哌醋甲酯单克隆抗体和权利要求4所述的组合物中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
7.一种检测哌醋甲酯的试纸条，其特征在于，所述试纸条含有权利要求1所述的杂交
8.根据权利要求7所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述结合垫上包被权利要求2所述哌醋甲酯单克隆抗体。
9.一种检测哌醋甲酯的芯片，其特征在于，所述芯片含有权利要求1所述杂交瘤细胞株、权利要求2所述的哌醋甲酯单克隆抗体和权利要求4所述的组合物中的至少一种。
10.权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求2所述的哌醋甲酯单克隆抗体、权利要求4所述的组合物、权利要求5-6所述的试剂盒、权利要求6-7所述的试纸条或权利要求9所述的芯片在检测哌醋甲酯中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一株分泌哌醋甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2024年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.46223，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为单克隆细胞株。
2.一种哌醋甲酯单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种哌醋甲酯半抗原，用于制备权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述哌醋甲酯半抗原的结构式为：
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株和/或权利要求2所述的哌醋甲酯单克隆抗体。
5.一种检测哌醋甲酯的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求2所述的哌醋甲酯单克隆抗体和权利要求4所述的组合物中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，刘情情，匡华，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，刘丽强，郝昌龙，宋珊珊，吴爱红，郭玲玲，胥欣欣，瞿爱华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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