【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学研究和生物，涉及一种肝癌研究模型的构建方法。该模型旨在通过构建免疫人源化肝癌pdx小鼠模型，为免疫治疗、药物筛选和抗肿瘤疗效评价提供科学依据。
技术介绍
1、目前，患者来源的异种移植(patient-derived xenograft,pdx)模型已广泛应用于癌症研究中。pdx模型将肿瘤患者的组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，保留了患者肿瘤的遗传和表型特征，是研究癌症生物学、筛选药物和评估化疗效果的重要工具。特别是在肝癌研究中，pdx模型能够有效地模拟患者的肿瘤特性，帮助研究肿瘤的分子机制和药物敏感性。然而，传统pdx模型存在一个显著缺陷：由于移植的肿瘤组织在免疫缺陷小鼠体内生长，该模型缺乏人类免疫系统，无法评估免疫治疗效果。
2、现有技术的缺点和不足：
3、1.免疫系统缺失：传统pdx模型中使用的免疫缺陷小鼠(如nod/scid小鼠或b-ndg小鼠)没有功能性的人类免疫系统，缺乏成熟的t细胞、b细胞和自然杀伤细胞。因此，该模型无法模拟人类免疫系统与肿瘤之间的复杂相互作用，限制了其在免疫治疗评估中的应用。
4、免疫治疗评估的局限性：随着免疫检查点抑制剂(如pd-1/pd-l1抗体)和肿瘤疫苗等免疫疗法的兴起，癌症免疫治疗逐渐成为肿瘤治疗的重要手段。然而，传统pdx模型无法用于评价这些免疫疗法的疗效，这大大限制了其在新型抗肿瘤疗法中的应用潜力。
5、2.异种移植排斥风险：为了引入人类免疫细胞以实现“人源化”，研究者尝试在pdx模型中移植人外周血单核细胞(pbmc)或c
6、3.模型稳定性和实验窗口有限：现有的人源化pdx模型的稳定性不高，尤其在移植物抗宿主反应出现后，实验窗口缩短，影响了模型的长期使用和治疗效果评估的稳定性。对于评估需要较长时间的治疗效果，如慢性免疫激活或持久的肿瘤抑制作用，现有技术的实验窗口较短，限制了模型的应用范围。
7、综上所述，现有技术在构建pdx模型方面已经取得了一定进展，但其在免疫系统重建和免疫治疗评估方面存在明显不足。因此，急需一种改进的免疫人源化肝癌pdx模型，能够在保留肝癌肿瘤特征的同时，重建功能性的人类免疫系统，以评估免疫疗法的疗效并延长实验窗口，为免疫治疗研究提供更科学可靠的模型支持。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术旨在提供一种用于免疫治疗评估的免疫人源化肝癌患者来源的异种移植(pdx)小鼠模型的构建方法。通过在传统pdx模型中引入人类免疫系统，使模型不仅保留患者肿瘤的遗传和表型特征，还能够重建功能性的人类免疫系统，能够更真实地模拟人类免疫与肿瘤之间的相互作用，为免疫治疗药物筛选和疗效评估提供创新、可靠的模型。
2、本专利技术的任务在于：
3、1.构建兼具人类肝癌特性和功能性人类免疫系统的模型：本专利技术通过构建免疫人源化的肝癌pdx模型，使其既保留肝癌患者肿瘤的分子特征，又包含人类免疫系统，以便更准确地反映人类肝癌的免疫微环境。
4、2.评估免疫治疗效果：该模型能够用于评估不同免疫治疗方案(如pd-1/pd-l1抗体、肿瘤疫苗等)的疗效，为免疫治疗的临床前研究提供有效工具，帮助筛选出针对肝癌的最优治疗方案。
5、3.延长实验窗口，优化模型稳定性：通过改进人源化方法，本专利技术力求减少移植物抗宿主病的发生率，从而延长实验窗口，提高模型的稳定性，满足长期研究的需求。
6、支持抗癌药物和联合疗法的开发与筛选：本专利技术的免疫人源化肝癌pdx模型可用于评估新型免疫药物的有效性，并探索其与现有疗法的联合作用，为肝癌精准医学和个体化治疗方案的研发提供科学依据。
7、通过该模型的构建，本专利技术旨在填补现有技术在肝癌免疫治疗研究中的空白，提升癌症模型的精准性和适用性，为肝癌患者的治疗开发带来突破性的进展。
8、本专利技术采用的具体方案为：
9、第一方面，本专利技术请求保护免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
10、步骤一、患者肿瘤组织的获取与处理：对获取的新鲜肝癌组织样本进行严格筛选和处理，经清洗、去除坏死组织后切割成小块，确保肿瘤活性及其基因组完整性；
11、步骤二、肝癌pdx模型的构建：将经步骤一处理后的肝癌组织移植到严重免疫缺陷小鼠体内，并建立传代模型，获得稳定的肝癌pdx模型；
12、步骤三、人类免疫系统的引入：在pdx模型稳定生长后，采用人外周血单核细胞pbmc移植的方法实现人源化，在小鼠尾静脉中注入pbmc细胞悬液，使人类免疫细胞在小鼠体内重建，获得兼具人类肝癌特性和免疫功能的肝癌pdx模型；
13、步骤四、免疫人源化模型的免疫功能监测：
14、使用流式细胞术定期检测外周血和肿瘤组织中的包括cd45+、cd3+、cd8+在内的免疫细胞标志物，监测人类免疫细胞在小鼠体内的重建情况，通过特定标志确定模型构建成功以及确保模型具有可靠的免疫应答功能。
15、作为对上述技术方案的进一步优化，上述步骤三中，所述pbmc细胞悬液的制备方法如下：向离心管中加入15ml细胞分离液，再加入17ml外周血与pbs等体积混合的混合液，保持离心管垂直，放入离心机中，室温下1200×g离心10分钟；取出离心管，快速将上清液倾倒入新的50ml离心管中；使用含2％胎牛血清的pbs清洗所得上清液2次，第1次300×g离心8分钟，弃上清，加入全新的2％胎牛血清的pbs，进行第2次清洗，120×g离心10分钟除去血小板，弃上清；所得细胞沉淀用无血清pbs重悬，将细胞浓度调整为5×108个/ml，获得pbmc细胞悬液。
16、作为对上述技术方案的进一步优化，上述步骤三中，使用cd34+造血干细胞替代pbmc进行人源化。
17、作为对上述技术方案的进一步优化，上述步骤四中，特定比例的cd45+人源性免疫细胞被认为是模型构建成功的标志；通过检测cd8+t细胞的包括grb和inf-γ在内的活化标志，评估免疫人源化pdx模型的t细胞活性，确保模型具有可靠的免疫应答功能。
18、第二方面，本专利技术请求保护采用上述构建方法构建的免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型。
19、第三方面，本专利技术请求保护上述免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型在肝癌免疫治疗评估方面的应用。
20、作为对上述应用的进一步优化，在成功构建的免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型上，采用免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗的单独或联合治疗，观察不同治疗方案对模型肿瘤生长的影响。
21、更进一步地，利用流式细胞术和组织病理分析评估各治疗组中免疫细胞的浸润情况和功能变化，以验证免疫治疗的效果。
22、更进一步地，所述免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤三中，所述PBMC细胞悬液的制备方法如下：向离心管中加入15mL细胞分离液，再加入17mL外周血与PBS等体积混合的混合液，保持离心管垂直，放入离心机中，室温下1200×g离心10分钟；取出离心管，快速将上清液倾倒入新的50mL离心管中；使用含2％胎牛血清的PBS清洗所得上清液2次，第1次300×g离心8分钟，弃上清，加入全新的2％胎牛血清的PBS，进行第2次清洗，120×g离心10分钟除去血小板，弃上清；所得细胞沉淀用无血清PBS重悬，将细胞浓度调整为5×108个/mL，获得PBMC细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤三中，使用CD34+造血干细胞替代PBMC进行人源化。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤四中，特定比例的CD45+人源性免疫细胞被认为是模型构建成功的标志；通过检测CD8+T细胞的包括GrB和INF-γ在内的活化标志，评估免疫人源化PDX模型的T细胞活性
5.采用权利要求1-4任意一种所述的构建方法构建的免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型。
6.根据权利要求5所述的免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型在肝癌免疫治疗评估方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用是指，在成功构建的免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型上，采用免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗的单独或联合治疗，观察不同治疗方案对模型肿瘤生长的影响。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：利用流式细胞术和组织病理分析评估各治疗组中免疫细胞的浸润情况和功能变化，以验证免疫治疗的效果。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述免疫检查点抑制剂为PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂或LAG-3抑制剂；所述肿瘤疫苗为CSF-VacGel肿瘤疫苗。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：采用免疫激活剂替代CSF-VacGel肿瘤疫苗，所述免疫激活剂为STING激动剂或TLR激动剂。
...【技术特征摘要】
1.免疫人源化肝癌患者来源的异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤三中，所述pbmc细胞悬液的制备方法如下：向离心管中加入15ml细胞分离液，再加入17ml外周血与pbs等体积混合的混合液，保持离心管垂直，放入离心机中，室温下1200×g离心10分钟；取出离心管，快速将上清液倾倒入新的50ml离心管中；使用含2％胎牛血清的pbs清洗所得上清液2次，第1次300×g离心8分钟，弃上清，加入全新的2％胎牛血清的pbs，进行第2次清洗，120×g离心10分钟除去血小板，弃上清；所得细胞沉淀用无血清pbs重悬，将细胞浓度调整为5×108个/ml，获得pbmc细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤三中，使用cd34+造血干细胞替代pbmc进行人源化。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤四中，特定比例的cd45+人源性免疫细胞被认为是模型构建成功的标志；通过检测cd8+t细胞的包括grb和inf-γ在内的活化标志，评估免疫人源化p...
【专利技术属性】
技术研发人员：方驰华，尹祥意，赵星阳，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。