【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
本专利技术涉及一种简化的多核苷酸序列检测方法，其适用于检测大量诊断标志物的存在，包括用于癌症、传染病和移植器官排斥反应的诊断标志物。这对于伴随诊断测试也非常有用，在这种测试中必须可靠且低成本地识别一组标志物。聚合酶链式反应(pcr)是一种众所周知且强大的技术，其用于扩增实验室和诊断样品中存在的dna或rna，直到它们能够被可靠地检测和/或定量。然而，当应用于研究含有低水平此类分子的核酸样品时，它存在许多局限性。第一，尽管该技术能够检测到少至单个目标分子，但由于样品中存在不想要的其他核酸序列的扩增，它容易产生假阳性结果。这使得用于启动反应的寡核苷酸引物的选择变得关键；这进而使得设计具有所需特异性水平的引物相对复杂。因此，今天市场上可获得的许多基于pcr的测试具有有限的特异性。第二个缺点是，基于pcr的方法的多重化(multiplexing)在实践中最多仅限于几十个目标序列(通常不超过10个)以避免引物-引物相互作用，导致需要相对窄的操作窗口。另一个问题是，由于pcr反应以指数方式循环，目标的定量变得困难；反应效率的微小变化对生成的可检测材料量有巨大影响。即使已经准备好合适的对照和校准，定量因此通常仅限于约3倍以内的准确度。最后，用于研究的通过pcr扩增方法所针对的区域中的突变可能会产生不想要的副作用。例如，曾经有美国fda批准的测试不得不被撤回的情况，因为目标生物体在测试引物针对的基因区域发生了突变，导致大量假阴性。相反，如果扩增针对特定的单核苷酸多态性(snp)，当存在野生型变体时，pcr方法通常会给出假阳性。避免这种情况需要非常仔细的引物
技术介绍
技术实现思路
0、概述
1、我们现在已经开发了一种改进的方法，其基于我们在早期专利中使用的焦磷酸解反应的经验，克服了这些限制中的许多限制。在这样做的过程中，它利用了焦磷酸解的双链特异性；这种反应在单链寡核苷酸底物或包括阻断基团或核苷酸错配的双链底物中不会有效进行。因此，根据本专利技术，提供了一种在核酸样品中检测一种或多种目标多核苷酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
2、(a)将样品引入第一反应混合物中，所述第一反应混合物包含：
3、i.单链探针寡核苷酸a0；和
4、ii.焦磷酸解酶；
5、其中目标序列与单链探针寡核苷酸a0退火，生成至少部分双链的第一中间产物，其中a0的3’端与目标序列形成双链复合物，并且其中a0从3’端沿3’-5’方向被焦磷酸解，生成至少部分消化的链a1；
6、(b)将第一反应混合物引入包含连接酶的第二反应混合物中，其中a1使用夹板进行连接形成a2，其中目标多核苷酸序列作为夹板或夹板包含寡核苷酸d，并且其中进行连接包括：
7、将a1的3’端与a1的5’端连接形成环状构建体；或
8、将a1的3’端与连接探针寡核苷酸c的5’端连接；
9、(c)将第二反应引入第三反应混合物中，并检测源自前一步骤产物的信号，其中产物是：
10、a2或其部分，或a2的多个拷贝或其部分的多个拷贝；并且
11、由此推断样品中一种或多种目标多核苷酸序列的存在或不存在，其中第一反应混合物、第二反应混合物和/或第三反应混合物中的一个或多个包含一种或多种消泡剂。
12、在一个实施方案中，该方法特征还在于组合第一反应混合物和第二反应混合物，使得第一反应混合物包含：
13、-单链探针寡核苷酸a0；
14、-焦磷酸解酶；和
15、-连接酶。
16、在一个实施方案中，该方法特征还在于该方法是一种在核酸样品中检测两种或更多种目标多核苷酸序列的方法，其中：
17、-第一反应混合物或第二反应混合物还包含单链探针寡核苷酸x0，x0包含第一目标互补(tc)区域、第二目标互补(tc)区域、第一引物结合位点和第二引物结合位点，其中第一tc区域与目标序列的第一区域退火，其中第二tc区域与目标序列的第二区域杂交，并且其中第一tc区域和第二tc区域彼此相邻地与目标退火，使得它们仅由一个切口分隔，其中x0不被焦磷酸解，并且x0通过第一tc区域和第二tc区域的连接针对(against)目标环化形成x1；
18、-检测步骤涉及检测源自前一步骤产物的信号，其中产物是：
19、i.a2或其部分，或a2的多个拷贝或其部分的多个拷贝；和/或
20、ii.x1或其部分，或x1的多个拷贝或其部分的多个拷贝；并且
21、由此推断样品中两种或更多种目标多核苷酸序列的存在或不存在。
22、本专利技术方法可应用的核酸是那些包含所寻求的目标多核苷酸序列的核酸，如天然存在的或合成的dna或rna分子。在一些实施方案中，核酸通常存在于含有它和其他生物材料的水溶液中，并且在一些实施方案中，核酸与不是该测试感兴趣的其他背景核酸分子一起存在。在一些实施方案中，核酸以相对于这些其他核酸成分的低的量存在。优选地，例如当核酸源自含有细胞材料的生物标本时，在执行该方法的步骤(a)之前，将使用样品制备技术如过滤、离心、色谱或电泳去除部分或全部这些其他核酸和外来生物材料。合适地，核酸源自取自哺乳动物(特别是人患者)的生物样品，如血液、血浆、痰液、尿液、皮肤或活检。在一些实施方案中，生物样品将被裂解，以便通过破坏存在的任何细胞来释本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在核酸样品中检测一种或多种目标多核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于组合第一反应混合物和第二反应混合物，使得第一反应混合物包含：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于该方法是一种在核酸样品中检测两种或更多种目标多核苷酸序列的方法，其中：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征还在于X0通过其3’端的化学修饰而对焦磷酸解具有抗性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征还在于化学修饰是硫代磷酸酯键。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征还在于第三反应混合物包含一种或多种消泡剂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征还在于消泡剂是基于硅酮的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征还在于消泡剂是消泡SE-15。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征还在于消泡剂是消泡B乳液。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征还在于消泡剂是消泡C乳液。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征还在于第三反应混合物包含至少一种与A0的一部分基本互补的单链引物寡核苷酸、任选地至少一种与X0的一部分基本互补的单链引物寡核苷酸和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。
13.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于部分消化的链A1通过其3'端和5'端的连接环化生成寡核苷酸A2。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征还在于第一反应混合物或第二反应混合物还包含连接探针寡核苷酸C，并且部分消化的链A1在3'端与C的5'端连接生成寡核苷酸A2。
15.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于第一反应混合物或第二反应混合物还包含5'-3'外切核酸酶，并且其中使得A0和任选地X0的5'端对5'-3'外切核酸酶消化具有抗性。
16.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于第一反应混合物或第二反应混合物还包含磷酸酶或磷酸水解酶。
17.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于在检测步骤之前或期间，用焦磷酸酶或外切核酸酶中的至少一种处理前一步骤产物。
18.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于寡核苷酸C还包含3'或内部修饰以保护其免受3'-5'外切核酸酶消化。
19.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于第一反应混合物或第二反应混合物还包含夹板寡核苷酸D，所述夹板寡核苷酸D包含与A1的3'端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5'端或A1的5'端互补的区域。
20.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于执行A0的焦磷酸解形成部分消化的链A1的酶也扩增A2和任选的X1。
21.一种试剂盒，其包含：
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其还包含寡核苷酸C，其中C的5'端与寡核苷酸D的区域或目标多核苷酸序列的区域互补，所述目标多核苷酸序列的区域不同于与A0的3'端互补的区域。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的试剂盒，其还包含寡核苷酸D，其中D包含与A0的从A0的3'端位于5'方向的区域互补的区域和与C的5'端或A0的5'端互补的区域。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的试剂盒，其还包含dNTP和一种或多种引物。
25.一种试剂盒，其包含：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种在核酸样品中检测一种或多种目标多核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于组合第一反应混合物和第二反应混合物，使得第一反应混合物包含：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于该方法是一种在核酸样品中检测两种或更多种目标多核苷酸序列的方法，其中：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征还在于x0通过其3’端的化学修饰而对焦磷酸解具有抗性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征还在于化学修饰是硫代磷酸酯键。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征还在于第三反应混合物包含一种或多种消泡剂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征还在于消泡剂是基于硅酮的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征还在于消泡剂是消泡se-15。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征还在于消泡剂是消泡b乳液。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征还在于消泡剂是消泡c乳液。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征还在于第一反应混合物或第二反应混合物还包含至少一种与a0的一部分基本互补的单链引物寡核苷酸、任选地至少一种与x0的一部分基本互补的单链引物寡核苷酸和脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleotidetriphosphate，dntp)。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征还在于第三反应混合物包含至少一种与a0的一部分基本互补的单链引物寡核苷酸、任选地至少一种与x0的一部分基本互补的单链引物寡核苷酸和脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)。
13.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征还在于部分消化的链a1通过其3'端和5'端的连接环化生成寡核苷酸a2。
14.根据权利要求1至...
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