【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开总体涉及用于从组织样本制备rna和从分离的rna制备空间转录组学文库的改进方法。
技术介绍
1、空间转录组学使得能够从新鲜冷冻和福尔马林固定的石蜡包埋的(ffpe)组织样本进行高度多重的、空间定位的基因表达分析。然而，由于ffpe组织的冷冻过程或固定过程，碎裂、降解和交联可能改变用于转录组学文库制备的rna和dna的质量和数量。目前市场上的空间工作流程捕获和转化组织切片内<1％的mrna。
技术实现思路
1、本文提供了从保存的组织样本(例如冷冻或ffpe组织样本)产生更高捕获和空间文库转化的方法。原位多聚腺苷酸化能够在寡核苷酸-dt表面上捕获片段化的ffpe rna。本文还提供了从分离的mrna转录物合成cdna以善mrna序列的总体合成和比对质量以及空间转录组学文库的制备的改进方法。
2、本公开提供了一种用于从样本分离rna的方法，所述方法包括(a)使从所述样本分离的总rna与多核苷酸激酶(pnk)接触以将3'磷酸修饰成羟基，从而产生末端修复的总rna；(b)使所述末端修复的总rna与多聚腺苷酸聚合酶(pap)和腺苷核苷酸接触以产生多聚腺苷酸化的总rna；(c)在包含一个或多个包含poly t序列的寡核苷酸的基底上捕获所述多聚腺苷酸化的总rna；以及(d)从所述基底洗脱所述多聚腺苷酸化的总rna。
3、在各种实施方案中，所述方法还包括定量所述总rna。在一些方面，使用量qubit或rt-qpcr来定量rna。
4、还提供了一种用于从
5、在各种实施方案中，通过裂解和/或透化所述组织样本来进行释放。
6、在各种实施方案中，所述rna包括rrna和/或mrna。
7、进一步考虑的是一种用于从组织样本制备mrna转录组文库的方法，所述方法包括：(a)使从所述样本分离的总rna与多核苷酸激酶(pnk)接触以将3'磷酸修饰成羟基，从而产生末端修复的总rna；(b)使所述末端修复的总rna与多聚腺苷酸聚合酶(pap)和腺苷核苷酸接触以产生多聚腺苷酸化的总rna；(c)从所述组织样本释放所述多聚腺苷酸化的总rna；(d)在包含一个或多个包含poly t序列的寡核苷酸的基底上捕获所述多聚腺苷酸化的总rna；(e)从所述总rna耗尽核糖体rna以留下多聚腺苷酸化的mrna；(f)使用mrna文库制备试剂盒从所述多聚腺苷酸化的mrna产生mrna文库。
8、在各种实施方案中，所述基底是小珠、小珠阵列、点样阵列、流通池(例如，成簇流通池)、排列在芯片的表面上的成簇颗粒、膜和板(例如，多孔板)。
9、在各种实施方案中，所述样本是新鲜冷冻组织样本或福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)样本。
10、在各种实施方案中，释放包括使所述样本与裂解缓冲液、透化缓冲液和/或试剂接触以使ffpe样本脱蜡。例如，当所述样本是载玻片上的ffpe样本时，所述方法包括在使所述rna与pnk接触之前，对载玻片上的所述样本进行透化和胶原酶处理。所述方法还可包括使所述ffpe样本解交联，任选地，其中使用ph 9的te缓冲液进行所述解交联。
11、在各种实施方案中，在多聚腺苷酸化后，polya尾为介于3与50个之间的核苷酸。
12、在各种实施方案中，产生所述rna文库包括以下步骤：从所述基底洗脱所述多聚腺苷酸化的总rna，并使用rna文库制备试剂盒从经洗脱的多聚腺苷酸化的rna文库产生所述rna文库。在一些实施方案中，产生所述rna文库包括：i)使分离的rna与逆转录酶(rt)或dna聚合酶接触以产生与所述rna互补的第一cdna链；ii)使所述第一cdna链与逆转录酶(rt)或dna聚合酶接触以产生与所述第一cdna链互补的第二cdna链；iii)扩增第二链cdna以形成pcr模板并分离所述pcr模板；以及iv)从所述pcr模板产生rna文库。
13、在各种实施方案中，在第二链合成期间或之前，添加第一聚类序列、索引序列和/或读段2序列中的一者或多者。
14、在各种实施方案中，rna文库是mrna文库。
15、在各种实施方案中，通过标签化进一步加工所述pcr模板以产生空间转录组学文库。在一些实施方案中，所述标签化包括小珠上标签化，其中所述小珠包含多个小珠连接的转座体(blt)。在一些实施方案中，blt包括i)包含第一聚类序列(p7)、第一索引序列和读段1测序引物(rd1 sp)的多个寡核苷酸，和ii)包含第二聚类序列(p5)、第二索引序列和读段2测序引物(rd2 sp)的多个寡核苷酸。
16、本公开还提供了一种用于提高用于原位mrna转录物文库制备的mrna转录物的捕获效率的方法，所述方法包括：(a)在基底上从样本捕获mrna转录物；(b)使所述基底与高持续合成能力逆转录酶(rt)接触以产生与所述mrna转录物互补的第一cdna链；(c)使所述第一cdna链与dna聚合酶接触以产生与所述第一cdna链互补的第二cdna链；(d)扩增第二链cdna以形成pcr模板并分离所述pcr模板。
17、在其他实施方案中，用于提高用于原位mrna转录物文库制备的mrna转录物的捕获效率的方法包括：(a)在基底上从样本捕获mrna转录物；(b)使所述基底与高持续合成能力逆转录酶(rt)接触以产生与所述mrna转录物互补的第一cdna链；(c)使所述第一cdna链与所述高持续合成能力逆转录酶(rt)或高持续合成能力dna聚合酶接触，以产生与所述第一cdna链互补的第二cdna链；以及(d)扩增第二链cdna以形成pcr模板并分离所述pcr模板。
18、在另外其他实施方案中，提供了一种用于改进用于产生原位转录组文库的多核苷酸的核苷酸长度的方法，所述方法包括：(a)在基底上从样本捕获mrna转录物；(b)使所述基底与高持续合成能力逆转录酶(rt)接触以产生与所述mrna转录物互补的第一cdna链；(c)使所述第一cdna链与高持续合成能力逆转录酶(rt)或高持续合成能力dna聚合酶接触，以产生与所述第一cdna链互补的第二cdna链；以及(d)扩增第二链cdna以形成pcr模板并分离所述pcr模板。
19、在各种实施方案中，所述高持续合成能力rt是superscript iv、热稳定ii组内含子rt(tgirt)或marathon rt。在各种实施方案中，所述高持续合成能力dna聚合酶是kle本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于从样本分离RNA的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，还包括定量所述总RNA。
3.一种用于从组织样本制备RNA文库的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述RNA包括rRNA和/或mRNA。
5.一种用于从组织样本制备mRNA转录组文库的方法，所述方法包括：
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基底是小珠、小珠阵列、点样阵列、流通池、排列在芯片的表面上的成簇颗粒、膜和板。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样本是新鲜冷冻组织样本或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中释放包括使所述样本与裂解缓冲液、透化缓冲液和/或试剂接触以使FFPE样本脱蜡。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中当所述样本是载玻片上的FFPE样本时，所述方法包括在使所述RNA与PNK接触之前，对所述载玻片上的所述样本进行透化和胶原酶处理。
10.根据权利要求7
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中polyA尾为介于3与50个之间的核苷酸。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中产生所述RNA文库包括以下步骤：从所述基底洗脱所述多聚腺苷酸化的总RNA，并使用RNA文库制备试剂盒从经洗脱的多聚腺苷酸化的RNA文库产生所述RNA文库。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中产生所述RNA文库包括：
14.根据权利要求3至13中任一项所述的方法，其中所述RNA文库是mRNA文库。
15.根据权利要求14所述的方法，其中通过标签化进一步加工所述PCR模板以产生空间转录组学文库。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述标签化包括小珠上标签化，其中所述小珠包含多个小珠连接的转座体(BLT)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述BLT包括：
18.一种用于提高用于原位mRNA转录物文库制备的mRNA转录物的捕获效率的方法，所述方法包括：
19.一种用于提高用于原位mRNA转录物文库制备的mRNA转录物的捕获效率的方法，所述方法包括：
20.一种用于提高用于原位mRNA转录物文库制备的mRNA转录物的捕获效率的方法，所述方法包括：
21.一种用于改进用于产生原位转录组文库的多核苷酸的核苷酸长度的方法，所述方法包括：
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述高持续合成能力RT是SuperscriptIV、热稳定II组内含子RT(TGIRT)或marathonRT。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述高持续合成能力DNA聚合酶是Klenow exo-、Bst 3.0或phi29。
24.一种用于从组织样本制备mRNA转录组文库的方法，所述方法包括：
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述基底是小珠、小珠阵列、点样阵列、流通池、排列在芯片的表面上的成簇颗粒、膜或板。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，其中所述样本是新鲜冷冻组织样本或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中释放包括使所述样本与裂解缓冲液、透化缓冲液和/或试剂接触以使FFPE样本脱蜡。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中当所述样本是载玻片上的FFPE样本时，所述方法包括在使所述RNA与PNK接触之前，对所述载玻片上的所述样本进行透化和胶原酶处理。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，还包括使所述FFPE样本解交联，任选地，其中使用pH 9的TE缓冲液进行所述解交联。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中polyA尾为介于3与50个之间的核苷酸。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中产生所述RNA文库包括以下步骤：从所述基底洗脱所述多聚腺苷酸化的总RNA，并使用RNA文库制备试剂盒从经洗脱的多聚腺苷酸化的RNA文库产生所述RNA文库。
32.根据权利要求24至31中任一项所述的方法，其中产生所述RNA文库包括：
33.根据权利要求24至32中任一项所述的方法，...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于从样本分离rna的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，还包括定量所述总rna。
3.一种用于从组织样本制备rna文库的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述rna包括rrna和/或mrna。
5.一种用于从组织样本制备mrna转录组文库的方法，所述方法包括：
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基底是小珠、小珠阵列、点样阵列、流通池、排列在芯片的表面上的成簇颗粒、膜和板。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样本是新鲜冷冻组织样本或福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)样本。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中释放包括使所述样本与裂解缓冲液、透化缓冲液和/或试剂接触以使ffpe样本脱蜡。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中当所述样本是载玻片上的ffpe样本时，所述方法包括在使所述rna与pnk接触之前，对所述载玻片上的所述样本进行透化和胶原酶处理。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，还包括使所述ffpe样本解交联，任选地，其中使用ph 9的te缓冲液进行所述解交联。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中polya尾为介于3与50个之间的核苷酸。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中产生所述rna文库包括以下步骤：从所述基底洗脱所述多聚腺苷酸化的总rna，并使用rna文库制备试剂盒从经洗脱的多聚腺苷酸化的rna文库产生所述rna文库。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中产生所述rna文库包括：
14.根据权利要求3至13中任一项所述的方法，其中所述rna文库是mrna文库。
15.根据权利要求14所述的方法，其中通过标签化进一步加工所述pcr模板以产生空间转录组学文库。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述标签化包括小珠上标签化，其中所述小珠包含多个小珠连接的转座体(blt)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述blt包括：
18.一种用于提高用于原位mrna转录物文库制备的mrna转录物的捕获效率的方法，所述方法包括：
19.一种用于提高用于原位mrna转录物文库制备的mrna转录物的捕获效率的方法，所述方法包括：
20.一种用于提高用于原位mrna转录物文库制备的mrna转录物的捕获效率...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁玥，L·斯托姆斯，C·爱普瑞，肖瑶，A·珀达，B·弗劳沃斯，M·埃卡斯特兰德，
申请(专利权)人：伊鲁米那股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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