【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种猪骨骼肌卫星细胞pscs和猪肾成纤维细胞pkfs共培养体系建立的方法。
技术介绍
1、人造肉(亦称为细胞培养肉或培育肉)是在组织工程的基础上，依据动物肌肉生长修复机理，利用细胞共培养等相关技术进行肉类生产，具有体外生产高效、绿色肉类的巨大潜力，因此越来越多的研究关注于细胞培养肉类技术。
2、目前，多数研究选用种子细胞选择单一，主要以肌细胞为主。例如2021年furuhashi m等选用牛肌细胞作为种子细胞，提出了一种肌细胞可沿长轴方向排列肌分化成肌管且在电刺激下收缩的3d培养的牛肌肉组织的培养方法；2022年陈彧等使用pscs探究其在三维水凝胶中的分化效果并且检测体外培养的肌肉组织的氨基酸含量；2019年macqueen la等在明胶纤维支架中培养牛主动脉平滑肌细胞和兔骨骼肌成肌细胞进行人造肉的生产。一块真正的肉是有一定的嫩度和多汁性，人造肉单一类型的种子细胞不适用于真实的人造肉的生产。2022年shahin-shamsabadi a等通过自组装逐层生物制造技术，通过添加小鼠脂肪细胞(3t3-l1)和骨骼肌细胞(c2c12)，生产了肌、脂混合肉，但是由于选用的是商业化鼠细胞系，无法进行大规模的生产。
3、功能良好的种子细胞是生产培养脂肪的关键，2022年song w等分离了adscs，优化了adscs在微载体(mcs)上的培养条件用于人造肉生产，但这类细胞存在分离流程繁琐、细胞活化后传代能力下降等缺点；并且在诱导分化的过程中，传统诱导方法称为“鸡尾酒”诱导法，这类方法存
4、2014年hongbo liu等利用pkfs用于克隆猪的生产，结果表明，pkfs表现出较高的增殖能力和克隆样形态，可用于体细胞核移植(scnt)；2012年richter a等使用具有稳定核型的培养基培养pkfs，结果表明pkfs可以维持长达71次传代，并且拥有较高的增殖率与转染效率；2023年pasitka l等选用原代鸡胚胎成纤维细胞(cef)作为人造肉种子细胞，实现了细胞自发永生化、无血清大规模培养与人造鸡肉的生产。pkfs作为人造肉潜在的种子细胞可替代adscs作为人造猪肉脂肪细胞来源，但诱导pkfs成脂的方法尚未报道。
5、所以，一个体外诱导pkfs转分化的方法和pkfs与pscs的共培养体系尤为迫切。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于建立体外诱导猪肾成纤维细胞pkfs转分化为脂肪细胞的方法流程、筛选最适的细胞共培养分化培养基和选择最适细胞共培养比例，提供了一种猪骨骼肌卫星细胞pscs和猪肾成纤维细胞pkfs共培养体系。
2、本专利技术所采取的技术方案是：一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，包括如下步骤：
3、1)将1-3日龄的仔猪放血后，清洗消毒皮肤表面，取仔猪肾脏分离pkfs细胞，取仔猪肌肉组织分离pscs细胞；
4、具体的，pscs细胞分离自1-3日龄仔猪的背最长肌和腿部肌肉。用手术剪刀将肌肉组织切成块，加入1xpbs溶液稀释肌肉。将悬浮液在2000g下离心5min，丢弃上清。在沉淀中加入2mg/ml i型胶原酶，37℃孵育约2小时。消化后，将细胞转移到添加10％ fbs的dmem中，先后通过100μm、70μm和40μm细胞滤镜过滤。差速离心2h后，可得到分离出的pscs细胞。
5、pkfs细胞分离自1-3日龄仔猪肾脏。去除肾被膜后，用剪刀将肾脏组织剪至糜烂状。用pbs清洗糜烂状组织三遍后，再将胰酶和i型胶原酶(1mg/ml)按照1:2的比例配置成混合液后，将所述混合液与清洗后的糜烂状组织按照1:1比例混合，于37℃5％培养条件下消化2-3h。消化后的组织先后过100μm、70μm细胞筛后，可得到分离出的pkfs细胞。
6、将得到的分离出的pkfs与pscs细胞用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基培养2～4天。待pkfs细胞生长密度为80％-90％、pscs细胞生长密度为70％-80％时，胰酶消化转移分别接种至t25细胞培养瓶中备用。
7、2)将油酸(oleic acid,oa)用dmso配置成0.7mol/loa原液，与10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基混合，配制成含25μm～800μm oa的pkfs转分化培养基；
8、3)取步骤1)得到的pkfs细胞接种于步骤2)制备的所述含25μm～800μm oa的pkfs转分化培养基进行诱导；
9、4)取步骤1)得到的的pscs细胞和pkfs细胞，胰酶消化后进行细胞计数，按照pscs：pkfs细胞数比例9:1～1:9，混合得到pscs和pkfs共培养细胞，备用。
10、5)将oa和pa混匀组合，用含5％胎牛血清(fbs)的dmem培养基进行稀释得到含有25μm～800μm oa+200μm～800μm pa的a液；将oa和pa混匀组合，用含5％马血清(hs)的dmem培养基进行稀释得到含有25μm～800μm oa+200μm～800μm pa的b液，对步骤4)得到的pscs和pkfs共培养细胞组合进行交叉培养。
11、优选地，步骤3)中，将棕榈酸(palmic acid,pa)粉末溶于无水乙醇配制成50mm的原液pa，对步骤2)得到的含oa的pkfs转分化培养基进行稀释，配制成含oa和pa的pkfs转分化培养基；另取步骤1)得到的pkfs细胞接种于含25μm～800μm oa和200μm～800μm pa的pkfs转分化培养基中进行诱导分化，诱导时间2～6天。
12、优选地，在本专利技术的pscs和pkfs共培养体系建立的方法中，步骤3)制备得到的最适pkfs转分化培养基的成分包括：600μm oa+200μm pa+10％fbsdmem。
13、优选地，在本专利技术的pscs和pkfs共培养体系建立的方法中，步骤5)中最适的共培养分化培养基包括：600μm oa+200μm pa+5％fbsdmem的a液、600μm oa+200μm pa+5％hsdmem的b液。
14、优选地，在本专利技术的pscs和pkfs共培养体系建立的方法中，步骤5)所述最适的共培养分化方法包括：按照a液处理12h、b液处理1天的规律，培养2～4次；
15、优选地，在本专利技术的pscs和pkfs共培养体系建立的方法中，步骤4)中pscs：pkfs最适的共培养细胞数比例是7:3。
16、在本专利技术的pscs和pkfs共培养体系建立的方法中，成脂诱导剂是oa和/或pa。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
18、本专利技术所建立的体外诱导pkfs转分化的方法和pkfs与pscs的共培养体系，改善了利用“鸡尾酒”成脂诱导后无明显脂滴产生和成脂、成纤维标志基因变化的现有技术缺陷；且通过在含oa的10％ dmem培养基中添加pa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪骨骼肌卫星细胞PSCs和猪肾成纤维细胞PKFs共培养体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，其特征在于，步骤3)还可以为：将棕榈酸(Palmic acid,PA)粉末溶于无水乙醇配制成50mM的原液PA，对步骤2)得到的含OA的PKFs转分化培养基进行稀释，配制成含OA和PA的PKFs转分化培养基；另取步骤1)得到的PKFs细胞接种于含25μΜ～800μMOA和200μM～800μMPA的PKFs转分化培养基中进行诱导分化，诱导时间为2～6天。
3.根据权利要求2所述的一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，其特征在于，步骤3)制备得到的最适PKFs转分化培养基的成分包括：600μM OA+200μMPA+10％FBSDMEM。
4.根据权利要求2所述的一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，其特征在于，步骤5)中最适的共培养分化培养基包括：含有600μM OA、200μM PA、5％FBSDMEM的A液、含有60
5.根据权利要求1或2所述的一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，其特征在于，步骤4)中PSCs：PKFs最适共培养细胞数比例是7:3，能诱导PSCs形成肌管且PKFs转分化形成脂滴。
6.根据权利要求1或2所述的一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，其特征在于，步骤5)所述最适的共培养分化方法为A液处理12h、B液处理1天的规律，培养2～4次。
...【技术特征摘要】
1.一种猪骨骼肌卫星细胞pscs和猪肾成纤维细胞pkfs共培养体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，其特征在于，步骤3)还可以为：将棕榈酸(palmic acid,pa)粉末溶于无水乙醇配制成50mm的原液pa，对步骤2)得到的含oa的pkfs转分化培养基进行稀释，配制成含oa和pa的pkfs转分化培养基；另取步骤1)得到的pkfs细胞接种于含25μμ～800μmoa和200μm～800μmpa的pkfs转分化培养基中进行诱导分化，诱导时间为2～6天。
3.根据权利要求2所述的一种猪骨骼肌卫星细胞和猪肾成纤维细胞共培养体系建立的方法，其特征在于，步骤3)制备得到的最适pkfs转分化培养基的成分包括：600μm o...
【专利技术属性】
技术研发人员：左波，高泽洋，徐在言，黄靖琦，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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