【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于菌株检测，具体涉及一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法。
技术介绍
1、对未知菌株的种进行鉴定是微生物学和相关领域研究中的一个重要环节，通过鉴定未知菌株的种属类别，能够了解其基本的生物学特性，如形态特征、培养及生理特性、生化特性等，通过对未知菌株的种进行鉴定有助于及时发现和控制传染病的传播。
2、目前对未知菌株的种鉴定的方法通常是通过将未知微生物菌种，进行培养基培养的生化反应，通过观察菌落在平板上生长的形态，产酸、产气，酶学反应等特有生化反应，pcr鉴定，生化鉴定仪器鉴定，血清学进行鉴定等方法对菌株进行鉴定。
3、然而，采用上述方法对未知菌株的种鉴定时，培养时间长，耗时，步骤繁琐，需要一定的经验和专业基础，特别是到种的鉴定仪器和试剂耗材昂贵，增加了对未知菌株的种鉴定成本，因此我们需要提出一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法来解决上述存在的问题，使其能够快速扫描出未知培养物的质谱荷质比的采集峰的个数及强度，进而确认未知物的微生物的种，降低对未知菌株的种鉴定成本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，能够快速扫描出未知培养物的质谱荷质比的采集峰的个数及强度，进而确认未知物的微生物的种，降低对未知菌株的种鉴定成本，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方
4、s1、收集多种已知的或经过鉴定的标准菌株，通过飞行时间质谱仪采集标准菌株的质谱数据，质谱数据包括峰的个数及强度，并建立特征数据库；
5、s2、将未知菌株接种在培养基中培养6-8小时，以获取足够的生物量；
6、s3、将培养后未知菌株进行前处理，再提取未知菌株表征蛋白质；
7、s4、将提取未知菌株表征蛋白质与基质混合，再将混合物点样到靶板上，获得未知菌株样品；
8、s5、使用飞行时间质谱仪对未知菌株样品检测，确定未知菌株样品的荷质比，并记录飞行时间质谱仪采集到的质谱数据；
9、s6、将未知菌株样品的质谱数据与特征数据库中标准菌株的质谱数据进行特征分析，找出与未知菌株最匹配的标准菌株，得出未知菌株的种属。
10、优选的，步骤s1中，所述飞行时间质谱仪在采集标准菌株的质谱数据时，先对标准菌株接种在培养基中培养6-8小时，然后再对培养后的标准菌株前处理，再提取标准菌株的表征蛋白质，然后将标准菌株的表征蛋白质与基质混合，获得标准菌株样品，再使用飞行时间质谱仪对标准菌株样品进行检测，分析标准菌株的质谱数据，最后建立特征数据库，飞行时间质谱仪针对一种标准菌株只需采集一次，后续未知菌株在鉴定时直接调取特征数据库内的质谱数据即可。
11、优选的，步骤s2中，所述未知菌株在接种时，需在无菌环境下操作，选择琼脂培养基或液体培养基进行清洗和消毒处理，将未知菌株制成悬浮液，然后使用无菌的棉签蘸取悬浮液至培养基上，最后将培养基置于温度在20℃-40℃的培养箱中培养。
12、优选的，步骤s3中，培养后未知菌株前处理的流程如下：
13、s31、将培养后未知菌株使用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎；
14、s32、采用离心方式将破碎后的细胞进行蛋白质分离，再使用不同孔径的滤膜对离心后的上清液进行过滤，获取蛋白质溶液；
15、s33、在蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵溶液进行沉淀30-60分钟，蛋白质溶液与饱和硫酸铵溶液添加的质量比例为1：3；
16、s34、将沉淀后的溶液去除上清液，获取的沉淀物即为未知菌株表征蛋白质。
17、优选的，步骤s4中，所述基质设置为烟酸、2,5-二羟基苯甲酸和介子酸中的其中一种，所述基质与未知菌株表征蛋白质的混合比例为1：1。
18、优选的，所述靶板设置为研磨钢靶或抛光钢靶，将混合物点样到靶板上时，先在靶板上点上一层薄的基质，待靶板上基质干燥后再在干燥的基质表面点上混合物。
19、优选的，步骤s5中，在对未知菌株样品检测时，先将未知菌株样品引入离子源进行电离，产生带电离子，带电离子在加速电压的作用下进行飞行时间质量分析，根据其飞行时间被分离并记录，通过数据采集系统生成质谱图，显示各离子的荷质比及其对应的峰强度信息。
20、优选的，步骤s6中，将未知菌株样品的质谱数据与标准菌株的特征数据库进行特征分析的流程如下：
21、s61、将未知菌株的质谱数据进行基线校正和去噪处理，然后从处理后的质谱图中检测出所有显著的峰，并识别每个峰所代表的离子种类；
22、s62、从特征数据库中调取含有s61中离子种类的标准菌株的质谱数据，并与未知菌株的质谱数据进行相似度计算；
23、s63、根据相似度计算结果对所有标准菌株进行排序，并筛选出与未知菌株最相似的几个标准菌株；
24、s64、将未知菌株的峰数量和位置信息与筛选出的标准菌株匹配，找出与未知菌株相似度和匹配度均为最高的标准菌株即为未知菌株的种属。
25、优选的，步骤s62中，相似度计算的步骤如下：
26、a1、设定未知菌株的离子种类特征为x，标准菌株的离子种类特征为y；
27、a2、使用相似度计算公式计算未知菌株特征与标准菌株特征的相似度d，相似度计算公式为：
28、d＝|x|/|y|*100％；
29、a3、将所有计算出的相似度值按从大到小的顺序进行排序。
30、优选的，步骤s64中，若找不出匹配度或相似度最高的标准菌株时，需将获取的未知菌株从dna序列上进行鉴定。
31、本专利技术提出的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，与现有技术相比，具有以下优点：
32、1、本专利技术利用飞行时间质谱仪物理化学手段方法，对不同微生物菌种在不同培养基的培养表达，产生的不同表征蛋白质进行飞行时间质谱荷质比的基质解析电离采集峰的个数及强度，再进行特征分析，收集一定数量的经过鉴定或者已知的标准菌株，在飞行时间质谱仪上进行采集并建立特征数据库，在后续的未知菌株的种的鉴定时，只需要将未知物进行简单的几小时的培养，再经过简单的前处理，就可以快速扫描出未知培养物的质谱荷质比的采集峰的个数及强度，进而确认未知物的微生物的种，降低一定的对未知菌株的种鉴定成本。
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1.一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤S1中，所述飞行时间质谱仪在采集标准菌株的质谱数据时，先对标准菌株接种在培养基中培养6-8小时，然后再对培养后的标准菌株前处理，再提取标准菌株的表征蛋白质，然后将标准菌株的表征蛋白质与基质混合，获得标准菌株样品，再使用飞行时间质谱仪对标准菌株样品进行检测，分析标准菌株的质谱数据，最后建立特征数据库，飞行时间质谱仪针对一种标准菌株只需采集一次，后续未知菌株在鉴定时直接调取特征数据库内的质谱数据即可。
3.根据权利要求2所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤S2中，所述未知菌株在接种时，需在无菌环境下操作，选择琼脂培养基或液体培养基进行清洗和消毒处理，将未知菌株制成悬浮液，然后使用无菌的棉签蘸取悬浮液至培养基上，最后将培养基置于温度在20℃-40℃的培养箱中培养。
4.根据权利要求3所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在
5.根据权利要求4所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤S4中，所述基质设置为烟酸、2,5-二羟基苯甲酸和介子酸中的其中一种，所述基质与未知菌株表征蛋白质的混合比例为1：1。
6.根据权利要求5所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：所述靶板设置为研磨钢靶或抛光钢靶，将混合物点样到靶板上时，先在靶板上点上一层薄的基质，待靶板上基质干燥后再在干燥的基质表面点上混合物。
7.根据权利要求6所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤S5中，在对未知菌株样品检测时，先将未知菌株样品引入离子源进行电离，产生带电离子，带电离子在加速电压的作用下进行飞行时间质量分析，根据其飞行时间被分离并记录，通过数据采集系统生成质谱图，显示各离子的荷质比及其对应的峰强度信息。
8.根据权利要求7所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤S6中，将未知菌株样品的质谱数据与标准菌株的特征数据库进行特征分析的流程如下：
9.根据权利要求8所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤S62中，相似度计算的步骤如下：
10.根据权利要求9所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤S64中，若找不出匹配度或相似度最高的标准菌株时，需将获取的未知菌株从DNA序列上进行鉴定。
...【技术特征摘要】
1.一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤s1中，所述飞行时间质谱仪在采集标准菌株的质谱数据时，先对标准菌株接种在培养基中培养6-8小时，然后再对培养后的标准菌株前处理，再提取标准菌株的表征蛋白质，然后将标准菌株的表征蛋白质与基质混合，获得标准菌株样品，再使用飞行时间质谱仪对标准菌株样品进行检测，分析标准菌株的质谱数据，最后建立特征数据库，飞行时间质谱仪针对一种标准菌株只需采集一次，后续未知菌株在鉴定时直接调取特征数据库内的质谱数据即可。
3.根据权利要求2所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤s2中，所述未知菌株在接种时，需在无菌环境下操作，选择琼脂培养基或液体培养基进行清洗和消毒处理，将未知菌株制成悬浮液，然后使用无菌的棉签蘸取悬浮液至培养基上，最后将培养基置于温度在20℃-40℃的培养箱中培养。
4.根据权利要求3所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤s3中，培养后未知菌株前处理的流程如下：
5.根据权利要求4所述的一种基于飞行时间质谱仪测定并鉴定微生物的种的方法，其特征在于：步骤s4中，所述基质设置为烟酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘兰，周培华，高晗，胡雄，雷云琛，钟文涛，杨滔，袁列江，李政，
申请(专利权)人：湖南省产商品质量检验研究院，
类型：发明
国别省市：
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