【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物传感，具体涉及一种新颖的检测胰腺癌血浆外泌体mirna-196a的抗污染液栅石墨烯晶体管生物传感器的制备方法。
技术介绍
1、近年来，胰腺癌的发病率呈明显的上升趋势，中国国家癌症中心 2021 年统计数据显示，胰腺癌占恶性肿瘤相关死亡率的第 6 位。胰腺导管腺癌(pdac) 是胰腺癌最常见类型，大多数pdac在晚期被诊断出来，不符合治疗性手术的条件,因此导致其诊断率几乎与死亡率一致。因此，pdac的早期诊断和筛查是降低患者死亡率的关键。细胞外泌体（ev）是健康和肿瘤细胞通过内吞途径大量释放的小细胞外囊泡（30-200nm），进入血液循环，使得细胞间通讯和货物转移成为可能。越来越多的研究表明，胰腺癌血浆外泌体mirna标志物有望用于胰腺癌检测，但检测癌症中低表达水平的细胞外泌体mirna仍然是一个挑战，因此开展此方面的检测具有重要意义。
2、目前，检测特定外泌体mirna的方法，例如逆转录聚合酶链反应技术（qrt-pcr），和流式细胞术，从采样到结果通常需要很长时间才能完成，并且需要复杂的处理步骤。近年来，已经开发了许多传感器技术来提高外泌体检测的检测限（lod）和特异性，包括石墨烯晶体管传感器、电化学电容式传感器、原位荧光法和表面增强拉曼散射等，其中只有少数研究专门检测胰腺患者样本中的外泌体生物标志物。
3、由于胰腺癌外泌体mirna标志物处于复杂的血浆传感环境及其低表达水平，现有的方法仍然缺乏检测癌症的特异性和能力。目前已经开发出牛血清蛋白（bsa）、聚乙二醇（peg）、两性多肽离子、
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测胰腺癌血浆外泌体mirna-196a的抗污染液栅石墨烯晶体管生物传感器的制备方法和应用。本专利技术中，设计了一种由和协同抗污染的液栅石墨烯晶体管生物传感器。
2、本专利技术提供了一种检测胰腺癌血浆外泌体mirna-196a的抗污染液栅石墨烯晶体管生物传感器，包括电子级玻璃和设置于所述电子级玻璃上的栅极、源极和漏极，包括源极和漏极之间设置有石墨烯沟道；所述栅极表面依次固定巯基修饰的dna单链探针、bsa、polyan及修饰方法。本专利技术将dna单链探针固定在石墨烯晶体管栅电极表面，dna可以和mirna-196a之间通过碱基互补配对进行杂化，从而改变晶体管与样本溶液之间的双电层界面特性，使石墨烯沟道中的电流发生变化，通过检测沟道中的电流变化，可以检测溶液中的微量mirna-196a；bsa通过吸附修饰在栅极，改善金电极的稳定性和生物相容性，同时作为阻断剂，占据栅极非特异性结合位点，避免非特异性吸附；polyan与金表面形成范德华力吸附，polyan（聚腺苷酸尾端）因其与水分子氢键形成和磷酸基团的负电荷等特性而具有较强的亲水性，使其在栅极表面形成一层亲水层，避免污染性生物分子的疏水性非特异性吸附。通过超速离心法，超离提取血浆外泌体，经0.5%tritonx-100裂解，进行临床样本检测。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、本专利技术提供了一种石墨烯晶体管生物传感器，包括衬底和设置于所述衬底上的栅极、源极和漏极；所述源极和漏极之间设置有石墨烯沟道；cvd单层石墨烯通过湿法转移到石墨烯沟道；所述栅极表面固定能够和mirna -196a碱基互补的单链dna生物分子探针；聚腺嘌呤和牛血清蛋白作为协同抗污染生物分子修饰在栅极。
5、（1）液栅石墨烯晶体管的制备
6、所述石墨烯晶体管由衬底、栅极、源极、漏极和石墨烯沟道组成。通过jsd-300蒸发镀膜系统，利用热蒸发镀膜法制得晶体管。晶体管的源极与漏极之间存在石墨烯沟道。将单层石墨烯平铺附着在晶体管源极与漏极沟道之上，得到石墨烯晶体管传感器。
7、（2）胰腺癌血浆外泌体mirna-196a的抗污染液栅石墨烯晶体管生物传感器的制备
8、室温黑暗条件下，将5¢端修饰巯基的单链dna探针修饰到栅极表面，使其巯基与金电极之间形成稳定的au-s键；随后利用bsa和polyan对金电极表面的亲和性，依次修饰bsa和polyan在栅极上。组建胰腺癌血浆外泌体mirna-196a的抗污染液栅石墨烯晶体管生物传感器。
9、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，采用掩模版法真空镀膜，所述真空的真空度3× 10-4~6 × 10-4 pa以下，更优选为4 × 10-4 pa。
10、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，所述栅极、源极和漏极，由铬层和金层组成，所述铬层位于衬底和金层之间。
11、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，所述铬层的蒸镀电流优选为170～180a，；所述金层的蒸镀电流优选为110～120 a。
12、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，蒸金的厚度在20～30 nm，蒸铬的厚度在3～4nm左右。
13、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，晶体管的石墨烯沟道的宽度为 0.2～0.3mm，石墨烯沟道的长度为4～8 mm。
14、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，所述单层石墨烯的宽度为 0.5～2 mm，石墨烯的长度为4～6 mm。
15、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，所述石墨烯的转移：采用湿法转移将单层石墨烯转移至源极和漏极之间的沟道上。
16、在上述制备方法中，所述步骤（1）中，石墨烯的转移完成后，需将所述转移后的产物进行退火，退火温度100～130 ℃，优选120 ℃。
17、在上述制备方法中，所述步骤（2）中，dna单链探针干粉用无酶水溶解，配制浓度优选为1 mm，栅极孵育条件为：在28℃下浸入10 ml探针孵育10~14小时，更优选地，孵育12小时。
18、在上述制备方法中，所述步骤（2）中，bsa的溶剂为0.1×pbs溶液，浓度0.05%~0.2%bsa，优选浓度为0.1%bsa。
19、在上述制备方法中，所述步骤（2）中,将已修饰探针的栅极浸于10 mlbsa中，孵育条件为：28 ℃条件下，修饰0.5~2小时，更优选为1小时。
20、在上述制备方法中，所述步骤（2）中, polyan中聚腺嘌呤链中腺嘌呤数量为4~20个，优选数量为8个，即polya8，序列为“5¢-aaaaaaaa-3¢”。polya8溶剂为0.1×pbs溶液，浓度为1~10 mm,优选为5 mm。
21、在上述制备方法中，所述步骤（2）中, 将已修饰探针和bsa的栅极浸于10mlpolyan中，孵育条件为：4 ℃条件下，修饰0.5~2小时，更优选为1小时。
22、通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
【技术保护点】
1.一种检测胰腺癌标志物的晶体管传感器，所述传感器金栅极表面修饰可检测早期胰腺癌血浆外泌体miRNA-196a的DNA单链探针，以及牛血清蛋白（BSA）和聚腺嘌呤（polyAn）协同抗污染设计。检测原理是通过标志物与探针之间的结合，标志物自身所带电荷引起狄拉克点电压或沟道电流的变化，通过检测狄拉克点电压或沟道电流的变化，实现传感。
2.根据权利要求1所述的用于检测前列腺癌早期胰腺癌血浆外泌体miRNA-196a的晶体管传感器抗污染设计及修饰方法，其特征在于BSA和polyAn协同抗污染设计，BSA作为阻断剂，polyAn形成亲水层，二者相互补充，协同作用，避免污染性生物分子的非特异性吸附。
【技术特征摘要】
1.一种检测胰腺癌标志物的晶体管传感器，所述传感器金栅极表面修饰可检测早期胰腺癌血浆外泌体mirna-196a的dna单链探针，以及牛血清蛋白（bsa）和聚腺嘌呤（polyan）协同抗污染设计。检测原理是通过标志物与探针之间的结合，标志物自身所带电荷引起狄拉克点电压或沟道电流的变化，通过检测狄拉克点电压...
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