【技术实现步骤摘要】
本申请属于真菌毒素检测，具体涉及一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条及其应用。
技术介绍
1、在葡萄酒的生产、储存和销售过程中，其质量安全问题一直备受关注。赭曲霉毒素a作为一种由曲霉属和青霉属真菌产生的有毒次级代谢产物，对人体健康具有潜在危害，可引发肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性甚至致癌性等不良影响。葡萄酒的酿造原料葡萄在田间生长、收获以及后续加工环节中，容易受到产毒真菌的污染，进而导致葡萄酒存在赭曲霉毒素 a 污染的风险。
2、目前，检测赭曲霉毒素 a 的方法众多，包括高效液相色谱法（hplc）、液相色谱-质谱联用法（lc-ms）等传统实验室检测技术。这些方法虽然具有较高的准确性和灵敏度，但往往需要复杂且昂贵的仪器设备、专业的操作人员以及繁琐的样品前处理步骤，检测周期较长，无法满足葡萄酒生产现场快速检测以及大量样品初步筛查的需求。而具有操作简单、无需大型仪器、检测速度快等优点的免疫层析技术逐渐受到广泛关注。然而，这种免疫层析试纸条主要用于定性检测（判断样品中有或无赭曲霉毒素 a），或者只能进行半定量检测（通过条带颜色深浅大致判断含量范围）。
3、公开号为cn106908599 a的中国专利申请公开了一种基于银纳米粒子与ru(phen)32+荧光微球间消光作用的免疫层析试纸条，用于快速检测葡萄酒和葡萄汁中污染的赭曲霉毒素a。以ru(phen)32+荧光微球作为荧光背景信号，其最大激发波长为450nm，将其与ota 检测抗原混匀喷涂在试纸条检测区域；采用spr 吸收峰450nm的球形银纳米
4、上述免疫层析试纸条只能用于定性检测，无法进行定量检测，且灵敏度、特异性等性能方面仍有提升空间。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本申请提供了一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条及其应用。该试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及pvc胶板组成。使用该试纸条进行检测时，待测物和硝酸纤维素膜上的赭曲霉毒素a-bsa抗原会共同竞争结合垫上的赭曲霉毒素a单克隆抗体-红色改性微球偶联物，根据颜色反应即可判断样本中是否含有赭曲霉毒素a。该试纸条还可与彩色微球免疫分析仪联用，对葡萄酒样品中的赭曲霉毒素含量进行定量检测。
2、为达到上述目的，本申请采用如下技术方案：
3、第一方面，本申请提供一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条。所述红色改性微球免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及pvc胶板，其中结合垫上固定有红色改性微球-赭曲霉毒素a单克隆抗体偶联物，硝酸纤维素膜上从左至右依次为t1检测线、t2检测线和质控线，t1检测线和t2检测线固定有不同浓度的赭曲霉毒素a-bsa抗原，质控线上固定有山羊抗鼠多克隆抗体。
4、第二方面，本申请提供一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条的应用，包括以下步骤：
5、将制得的红色改性微球免疫层析试纸条套上卡壳做成试纸条成品；
6、然后将不同浓度的赭曲霉毒素a溶液用碳酸盐溶液稀释，配制成不同浓度的赭曲霉毒素a标准待测溶液；
7、随后将赭曲霉毒素a标准待测溶液分别滴加至试纸条成品的加样孔中，然后将试纸条放入孵育器中进行层析反应；
8、层析反应完成后由低浓度到高浓度将试纸条插入红色改性微球免疫分析仪中，测定t1检测线、t2检测线和质控线的吸光值；
9、将不同浓度的赭曲霉毒素a标准待测溶液的检测线和质控线的吸光值比值记为（t1+t2）/c值，并与不同浓度的赭曲霉毒素a标准待测溶液进行拟合，得到赭曲霉毒素a标准待测溶液的浓度与（t1+t2）/c值的标准关系曲线；
10、将待测样品以同样的方法，用碳酸盐溶液稀释混匀，滴加到试纸条加样孔中，然后将试纸条放入孵育器中进行层析反应；
11、反应完成后将试纸条插入红色改性微球免疫分析仪中，测得（t1+t2）/c值，根据赭曲霉毒素a待测样品的浓度与（t1+t2）/c值的标准关系曲线，即可计算得出待测样品中赭曲霉毒素a的含量。
12、有益的技术效果：
13、相比于现有技术的免疫层析试纸条主要用于定性检测（判断样品中有或无赭曲霉毒素 a），或者只能进行半定量检测（通过条带颜色深浅大致判断含量范围），本申请提供的红色改性微球免疫层析试纸条能够在10 min内实现对红葡萄酒和白葡萄酒中赭曲霉毒素a的定量检测，具有精密度高、准确度高的特点。且该免疫层析试纸条中使用的红色微球经过了表面改性，使得其表面羧基增多，可以更好地与赭曲霉毒素a单克隆抗体形成偶联物，同时使得其特异性更强。
14、本申请提供的方法对葡萄酒中赭曲霉毒素a的灵敏度高，最低检测限为1 μg/ml，定量检测范围1~20 μg/ml，符合国内和欧盟对葡萄酒中赭曲霉毒素a的限量标准，为葡萄酒中赭曲霉毒素a的快速定量检测提供重要的工具。
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1.一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述红色改性微球免疫层析试纸条包括样品垫（1）、结合垫（2）、硝酸纤维素膜（6）、吸水纸（7）及PVC胶板（8），其中结合垫（2）上固定有红色改性微球-赭曲霉毒素A单克隆抗体偶联物，硝酸纤维素膜（6）上从左至右依次为T1检测线（3）、T2检测线（4）和质控线（5），T1检测线（3）和T2检测线（4）固定有不同浓度的赭曲霉毒素A-BSA抗原，质控线（5）上固定有山羊抗鼠多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述红色改性微球-赭曲霉毒素A单克隆抗体偶联物的制备方法包括以下步骤：
3. 根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，制备红色改性微球的过程中，所述红色微球包括表面含有羧基的聚苯乙烯微球，平均粒径为50~400nm；所述单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸中的一种或多种；所述乳化剂包括十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠中的一种或两种；所述引发剂包括过硫酸钾、过氧化二异丙苯
4.根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述红色改性微球、第一缓冲液、碳二亚胺的质量比为（40~50）：（40~60）：（1~5）；所述第一混合液、第一缓冲液、赭曲霉毒素A单克隆抗体、封闭液、第二缓冲液的质量比为（10~20）：（20~30）：（10~20）：（20~30）：（20~30）。
5.根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述第一缓冲液的离子浓度为15~30mM，pH为8.0~10.0；所述第一缓冲液的成分包括蔗糖、BSA以及硼酸缓冲液；所述蔗糖、BSA以及硼酸缓冲液的质量比为（5~10）：（1~3）：（87~94）。
6.根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述封闭液的离子浓度为15~30mM，pH为7.0~9.0；所述封闭液的成分包括BSA、甘氨酸以及硼酸缓冲液；所述BSA、甘氨酸以及硼酸缓冲液的质量比为（0.5~3）：（0.1~1）：（96~99.4）。
7.根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述第二缓冲液的离子浓度为10~30mM，pH为8.0~10.0；所述第二缓冲液的成分包括蔗糖、海藻糖、BSA以及硼酸缓冲液；所述蔗糖、海藻糖、BSA以及硼酸缓冲液的质量比为（5~10）：（1~3）：（1~3）：（84~94）。
8. 根据权利要求1所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述T1检测线（3）上赭曲霉毒素A-BSA抗原的浓度为0.5~1.5 mg/mL；所述T2检测线（4）上赭曲霉毒素A-BSA抗原的浓度为0.3~1.2 mg/mL；所述质控线（5）上山羊抗鼠抗体的浓度为0.05~0.3 mg/mL；所述T1检测线（3）、T2检测线（4）及质控线（5）之间的间隔为0.5~1.5cm。
9.根据权利要求1所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述红色改性微球-赭曲霉毒素A单克隆抗体偶联物以喷涂的方式固定在结合垫（2）上，喷涂量为4~10μL/cm。
10.根据权利要求1~9中任意一项所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条的应用，其特征在于，包括以下步骤：
11. 根据权利要求10所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的红色改性微球免疫层析试纸条的应用，其特征在于，所述赭曲霉毒素A溶液的浓度为0~20 μg/mL；所述碳酸盐溶液为含1~5%Tween-20、30~100 mM 的碳酸盐溶液；所述滴加至试纸条成品的加样孔中的赭曲霉毒素A标准待测溶液的滴加量为100μL；所述孵育器中进行的层析反应，温度为30~50℃进行层析反应6~15min；所述T1检测线（3）、T2检测线（4）及质控线（5）之间的间隔为0.5~1.5cm。
...【技术特征摘要】
1.一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述红色改性微球免疫层析试纸条包括样品垫（1）、结合垫（2）、硝酸纤维素膜（6）、吸水纸（7）及pvc胶板（8），其中结合垫（2）上固定有红色改性微球-赭曲霉毒素a单克隆抗体偶联物，硝酸纤维素膜（6）上从左至右依次为t1检测线（3）、t2检测线（4）和质控线（5），t1检测线（3）和t2检测线（4）固定有不同浓度的赭曲霉毒素a-bsa抗原，质控线（5）上固定有山羊抗鼠多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述红色改性微球-赭曲霉毒素a单克隆抗体偶联物的制备方法包括以下步骤：
3. 根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，制备红色改性微球的过程中，所述红色微球包括表面含有羧基的聚苯乙烯微球，平均粒径为50~400nm；所述单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸中的一种或多种；所述乳化剂包括十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠中的一种或两种；所述引发剂包括过硫酸钾、过氧化二异丙苯、偶氮二异丁腈中的一种或多种；所述设定温度为60~ 80℃；所述红色微球、单体、乳化剂、引发剂的质量比为（10~20）：（70~90）：（1~5）：（0.5~2）。
4.根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述红色改性微球、第一缓冲液、碳二亚胺的质量比为（40~50）：（40~60）：（1~5）；所述第一混合液、第一缓冲液、赭曲霉毒素a单克隆抗体、封闭液、第二缓冲液的质量比为（10~20）：（20~30）：（10~20）：（20~30）：（20~30）。
5.根据权利要求2所述的一种检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的红色改性微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述第一缓冲液的离子浓度为15~30mm，ph为8.0~10.0；所述第一缓冲液的成分包括蔗糖、bsa以及硼酸缓冲液；所述蔗糖、bsa以及硼酸缓冲液的质量比为（5~10）：（1~3）：（87~94）。
6.根据权利要求2所述的一种检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖理文，谈婷，丁丽，周云维，李林岳，薛昭，
申请(专利权)人：南京微测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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