【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种用于生物合成重组小rna中内毒素的去除方法及应用。
技术介绍
1、rnai技术可以高效特异性抑制特定基因的表达，被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。截止2022年全球已经批准上市的rna类药物有17种，并且有几百种rna类药物正处于临床试验阶段。然而，对rna功能的研究和基于rna疗法的开发有赖于高效获得大量安全的同质性的rna原料以及高效、耐用的rna定量分析方法。
2、申请号为cn201810595579.9的专利公开了一种重组小rna的生产方法，该方法以trna为支架，嵌合mirna前体，在大肠杆菌中表达目标小rna，该方法具有经济、实用、便捷、有效、易于规模化和生产周期短等特点，也为体外/体内rna结构、相互作用和功能研究提供了一套有用的工具，有助于推动非编码rna的功能研究以及rna类新药的研发。
3、但是该方法采用大肠杆菌表达的重组rna属于生物制剂，存在内毒素污染问题。内毒素会导致机体多种病理生理效应，如高热、腹泻、感染性休克、甚至死亡等。而目前国内无上市的生物合成rna类制剂，如何以经济高效快速的方式去除重组小rna中的内毒素也是生产者极为关注的问题。为了提高重组小rna产品的安全性，建立高效、耐用的方法去除重组小rna原料中的内毒素是必要的。
技术实现思路
1、针对包括重组小rna在内的生物合成rna类制剂的内毒素问题，本专利技术的目的在于通过对不同内毒素方法的比较和筛选，提供一种针对
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种用于生物合成重组小rna中内毒素的去除方法，包括以下步骤：
4、s1、从大肠杆菌中提取总rna，采用强阴离子交换柱在fplc中对所述总rna进行分离纯化，得到重组小rna；
5、s2、利用分子量大小为20kd的第一超滤膜对所述重组小rna脱盐和浓缩，得到重组小rna浓缩液；
6、s3、利用分子量大小为120kd的第二超滤膜对所述重组小rna浓缩液进行超滤，即得到去除了内毒素的重组小rna。
7、进一步地，步骤s1中，所述重组小rna包括trna支架、mirna前体序列以及目的小rna序列；
8、所述目的小rna序列为mirna、sirna、shrna或rna适配体。
9、进一步地，所述trna支架包括人丝氨酸trna、人谷氨酸trna、人半胱氨酸trna、人亮氨酸trna、人赖氨酸trna、人谷氨酰胺trna、人酪氨酸trna和细菌甲硫氨酸trna。
10、进一步地，所述重组小rna包括人丝氨酸trna支架、mir-34a前体序列以及嵌合mir-34a成熟序列，即所述重组小rna为trnaser-34a；
11、步骤s1中，在所述从大肠杆菌中提取总rna之前，还包括对所述trnaser-34a进行表达，具体为：
12、将trnaser-34a表达质粒转化hst08感受态细菌，加入lb培养基培养，收集菌泥加入醋酸镁-tris·hcl溶液重悬，再加入饱和苯酚，收集水相，加入nacl溶液沉淀大分子杂质，收集上清液，在上清液中加入无水乙醇，进行离心后，得到总rna。
13、进一步地，步骤s1中，所述采用强阴离子交换柱在fplc中对所述总rna进行分离纯化，具体为：
14、采用离子交换柱对总rna进行分离纯化，其中采用流动相a、流动相b以及流速如下：
15、流动相a：10mm nah2po4溶液，ph7.0；
16、流动相b：10mm nah2po4溶液，1m nacl溶液，ph7.0；
17、流速为2.0ml/min，以depc水，流动相a，流动相b分别交替冲洗色谱柱；
18、对总rna进行分离采用以下程序：
19、采用0％流动相b进行分离0～5min，采用55％流动相b进行分离5～12min，采用55～75％流动相b进行分离12～45min，采用75～85％流动相b进行分离45～70min，采用100％流动相b进行分离70～80min，再采用0％流动相b进行分离80～85min，得到trnaser-34a。
20、进一步地，步骤s2中，所述第一超滤膜为再生纤维素膜；
21、步骤s2中，所述重组小rna进行脱盐浓缩处理条件为：在重组小rna溶液中加入2倍体积的乙醇，低温条件下放置10-60min，然后在4℃转速为8000-10000转条件下，离心10min，获得重组小rna固体；再利用20kd的第一超滤膜，在4℃转速为8000-10000转条件下进行离心过滤，获得重组小rna浓缩液。
22、进一步地，步骤s3中，所述第二超滤膜为再生纤维素膜；
23、所述利用分子量大小为120kd的第二超滤膜对所述重组小rna浓缩液进行超滤，包括以下步骤：
24、s301、制备trnaser-34a溶液，将trnaser-34a溶液用depc水稀释至200-800μg/ml；
25、s302、取trnaser-34a溶液至120kd ultra centrifugal filters中，在转速为8000-10000转，温度为4℃条件下，离心10min，收集得到第一滤液；
26、s303、再加入depc水至120kd ultra centrifugal filters中，在转速为8000-10000转，温度为4℃条件下，离心10min，收集得到第二滤液，将所述第一滤液和所述第二滤液混合，即得到去除了内毒素的trnaser-34a。
27、进一步地，所述步骤s303中，得到去除了内毒素的trnaser-34a之后，还包括：
28、s304、检测超滤前后trnaser-34a溶液浓度以及内毒素水平(eu/ml)，按下式计算不同批次trnaser-34a溶液中细菌内毒素的去除率q及有效成分的回收率r:
29、
30、式中，c超为超滤后溶液中细菌内毒素的含量(eu/ml)；c原为超滤前原液中细菌内毒素的含量(eu/ml)；
31、
32、式中，c超为超滤后水相中trnaser-34a含量(μg/ml)；c原为超滤前原液中trnaser-34a含量(μg/ml)，v超为超滤后收集水层溶液体积(ml)；v原为超滤前加入trnaser-34a溶液的体积(ml)。
33、进一步地，所述重组小rna中内毒素去除率在72％以上；
34、所述重组小rna的回收率在93％以上。
35、同时，本专利技术还提供一种如上述的用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
6.根据权利要求1-5任一所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
9.根据权利要求8所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法，其特征在于：
10.一种如权利要求1-9任一项所述的用于生物合成重组小RNA中内毒素的去除方法在去除以细菌发酵为来源的RNA中内毒素的应用。
【技术特征摘要】
1.一种用于生物合成重组小rna中内毒素的去除方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于生物合成重组小rna中内毒素的去除方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的用于生物合成重组小rna中内毒素的去除方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的用于生物合成重组小rna中内毒素的去除方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的用于生物合成重组小rna中内毒素的去除方法，其特征在于：
6.根据权利要求1-5...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽亚，骞婧，闫孟迪，
申请(专利权)人：西安艾领克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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