【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制造和组织工程，具体为基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺。
技术介绍
1、目前主要用于制造细胞膜片的方法主要有温度敏感培养系统、酶敏感培养系统、光敏感性培养系统、离子敏感性培养系统和ph敏感性培养系统，其中由温敏性材料构建的温度敏感性培养系统由于操作简单、易于控制等优点已经被广泛应用于组织工程细胞片的制备。许多温敏性材料存在最低临界溶解温度(loner critical solation temperature，lcst)，当外界温度高于lcst时，其呈现疏水性，细胞可以粘附在其表面并生长形成细胞片，而当温度低于lcst时，其逐渐由疏水转变为亲水状态，从而不利于细胞粘附，导致细胞自然脱附，进而可以获得完整的细胞片结构；通过向培养基底中引入酶敏感性的材料，再接种细胞进行培养，待细胞增殖形成完整的片层结构后，加入特异性的酶使基底发生降解，也可以用于获取细胞片，优点是基底材料具有良好的生物相容性，且原料易得、成本低廉；基于光敏感性材料构建光响应性的培养体系，并通过光照改变基底对细胞的粘附性，也可以用于制备和收获细胞片。该方法操作简单，对细胞的直接损害小；离子敏感性培养系统一般利用的是基底材料对离子的响应特性，当改变离子含量时，会引起基底材料发生降解或解离，从而将表面粘附生长的细胞释放出去，对细胞几乎无损害；ph敏感性系统主要基于ph响应性材料，通过改变环境ph值使得培养基底材料发生降解或解离，导致粘附在其表面的细胞自然脱离而获得细胞片。
2、目前主要用于制造仿生基底膜的材料有简单的多孔聚
3、但由于高度依赖湿度和温度等环境因素，静电纺丝在再现性方面受到限制。静电纺丝过程中使用的溶剂和高压的选择也会导致生物分子生物活性的丧失。在某种程度上，合成水凝胶与ecm相似，因为存在通过水溶胀环境中的共价和非共价相互作用形成的聚合物网络。通过控制交联和分子密度来微调其体积机械性能有利于将其用作bm模拟物。水凝胶的生物功能化是通过掺入胶原蛋白和层粘连蛋白等蛋白质中发现的短肽序列来实现的，这通过整合素与水凝胶模拟物增强细胞结合。另一个方面是能够用生长因子人工富集合成水凝胶，这些生长因子调节类似于天然bm微环境的各种细胞相互作用和行为。含有细胞的3d水凝胶可用于使用微挤出、激光辅助、喷墨和立体光刻等打印技术模拟复杂的组织结构，其突出特性在广泛的生物医学应用中显示出巨大的前景。
技术实现思路
1、（一）解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于研发一种基于细胞膜片制造、转印和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，用于提高构建体外皮肤组织模型的仿生性和效率，推动构建体外组织模型的进步与发展。
3、（二）技术方案
4、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种新型的细胞膜片的制造和转印工艺，包括细胞膜片的制造和转印技术以及含有多肽的水凝胶的制造技术,通过简易的操作制造出所需的细胞膜片并能够快速用于转印，采用多肽修饰一种具有力学强度的水凝胶，改善细胞的粘附性的同时还兼具一定的力学强度，水凝胶的孔隙也有利于细胞之间的通信与营养物质的交换。
5、优选的，所述的细胞膜片的制造和转印工艺包括pdms的制备、pdms表面的亲水性改性、细胞膜片的培养和细胞膜片的转印技术。pdms的制备通过购得的预聚物和固化剂按照10：1的比例搅拌混合再进行固化得到；pdms的亲水性改性通过先进行等离子处理，再用pva溶液浸泡实现；细胞膜片的培养通过将改性后的pdms先进行紫外线灭菌，再用pbs浸泡除去酒精，再将细胞接种在pdms上待细胞长满即可得到；细胞膜片的转印技术则通过将细胞膜片放置在用培养基润湿的特制的待转印表面上，然后等待一段时间即可。
6、优选的，所述的含有多肽的水凝胶作为仿生基底膜的制造工艺，通过先将选定的多肽溶于hepes缓冲液中，再加入分子量为600的pegda聚乙二醇二丙烯酸酯搅拌溶解，最后加入光引发剂lap苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂快速搅拌溶解，将所得溶液用紫外灯照射进行光固化，即可得到含有多肽修饰的水凝胶。
7、一种含有多肽的水凝胶作为仿生基底膜的制造工艺，于采用多肽修饰一种具有力学强度的水凝胶，改善了细胞的粘附性的同时还兼具一定的力学强度，水凝胶的孔隙也有利于细胞之间的通信与营养物质的交换。
8、所述的含有多肽的水凝胶作为仿生基底膜的制造工艺，通过先将选定的多肽溶于hepes缓冲液中，再加入分子量为600的pegda（聚乙二醇二丙烯酸酯）搅拌溶解，最后加入光引发剂lap（苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂）快速搅拌溶解，将所得溶液用紫外灯照射进行光固化，即可得到含有多肽修饰的水凝胶。
9、一种基于细胞膜片制造、转印和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺方法，包括如下操作步骤：
10、a.将含有多肽的水凝胶放置在紫外灯下30分钟进行灭菌处理；
11、b.将培养好的细胞膜片表面的培养基全部去除，然后用pbs沿着培养皿的侧壁进行冲洗，再用培养基将水凝胶的表面润湿；
12、c. 用镊子将细胞膜片慢慢夹持起来，然后缓缓放在水凝胶的表面，再将两者一起放在37℃，5%co2的培养箱中一段时间；
13、d.将水凝胶从培养箱中拿出，用镊子取下pdms，然后加入培养基，再将水凝胶放入培养箱中进行培养；
14、e.及时进行换液的工作直到细胞膜片与水凝胶基底膜形成稳定的连接，然后再更换培养基进行细胞的分化；
15、f.培养一段时间后进行皮肤表达物的测定，验证所得皮肤模型的生物功能。
16、（三）有益效果
17、与现有技术相比，本专利技术提供了基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，具备以下有益效果：
18、该基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，通过采用全新的细胞膜片的制造工艺，材料简单易得，成本低，效率高，采用新的工艺制造水凝胶仿生基底膜，采用多肽修饰改善细胞黏附性，同时具备了良好的力学性能和生物特性； 本次设计将上述两种工艺结合，有利于提高构建体外皮肤组织模型的仿生性和效率，制得的皮肤模型具有良好的生物特性；本专利技术所述工艺利用细胞膜片制造、转印技术和含多肽水凝胶制造技术实现了体外皮肤组织模型的高效制造和仿生性制造；该工艺具有操作简单、材料易得、可复现性强、可批量生产、生物功能性好等优点，适用于构建体外皮肤组织模型。
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1.基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，包括细胞膜片（17）的制造和转印技术以及含有多肽（13）的水凝胶的制造技术, 其特征在于，通过简易的操作制造出所需的细胞膜片（17）并能够快速用于转印。
2.根据权利要求1所述的基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，其特征在于，所述的细胞膜片（17）的制造和转印工艺包括PDMS（6）的制备、PDMS（6）表面的亲水性改性、细胞膜片（17）的培养和细胞膜片（17）的转印技术；PDMS（6）的制备通过购得的预聚物（2）和固化剂（3）按照10：1的比例搅拌混合再进行固化得到；PDMS（6）的亲水性改性通过先进行等离子处理，再用PVA溶液（7）浸泡实现；细胞膜片（17）的培养通过将改性后的PDMS（6）先进行紫外线灭菌，再用PBS浸泡除去酒精，再将细胞接种在PDMS（6）上待细胞长满即可得到；细胞膜片（17）的转印技术则通过将细胞膜片（17）放置在用培养基润湿的特制的待转印表面上，然后等待一段时间即可。
3.根据权利要求1所述的基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，其特征在于
4.根据权利要求1所述的基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，其特征在于，包括以下步骤；
...【技术特征摘要】
1.基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，包括细胞膜片（17）的制造和转印技术以及含有多肽（13）的水凝胶的制造技术, 其特征在于，通过简易的操作制造出所需的细胞膜片（17）并能够快速用于转印。
2.根据权利要求1所述的基于细胞膜片转印技术和含多肽水凝胶的皮肤模型制造工艺，其特征在于，所述的细胞膜片（17）的制造和转印工艺包括pdms（6）的制备、pdms（6）表面的亲水性改性、细胞膜片（17）的培养和细胞膜片（17）的转印技术；pdms（6）的制备通过购得的预聚物（2）和固化剂（3）按照10：1的比例搅拌混合再进行固化得到；pdms（6）的亲水性改性通过先进行等离子处理，再用pva溶液（7）浸泡实现；细胞膜片（17）的培养通过将改性后的pdms（6）先进行紫外线灭菌，再用pbs浸泡除去酒精...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘媛媛，靳翱翔，陆春祥，张毅，刘华振，杨士模，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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