【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，具体涉及一种检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的核酸组合和检测方法。
技术介绍
1、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，简称icc)是胆管癌(cholangiocarcinoma，cca)的一个重要亚型，约占所有原发性肝癌的10％-20％。icc是一种致命的原发性肝癌，但icc早期症状不明显，患者通常在晚期不可切除阶段才被诊断出来，治疗选择有限且预后不佳，因而迫切需要及时的诊断和治疗手段。
2、随着测序技术的发展，融合基因的产生被发现是癌症发生和进展的重要驱动因素之一。
3、在icc中，主要的融合突变基因是成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growthfactor receptor 2，fgfr2)驱动的融合基因，超过15％的icc患者中存在fgfr2基因融合突变。
4、icc中fgfr2的融合伴侣基因众多，目前研究发现已超过150种；其中大部分fgfr2驱动的融合基因组成结构有一个固定模式：在n端，融合蛋白共享一个几乎相同的fgfr2部分，包括完整的激酶结构域(fgfr2 exon1-17)，在c端，有一个由不同融合伴侣基因提供的二聚化/寡聚化结构域，伴侣基因包括bicaudal家族rna结合蛋白1(bicc1)、腺苷同型半胱氨酸酶1(ahcyl1)和periphilin 1(pphln1)等，该模式显示胆管癌中fgfr2驱动的融合基因的断点大部分位于fgfr217号外显子末端。
5、fgfr2基因与b
6、目前用于检测融合基因的方法主要包括染色体核型分析、荧光原位杂交(fish)、实时荧光pcr(rt-pcr)以及二代测序(ngs)法等。前两种技术是常用的临床辅助诊断方法，但灵敏度十分有限。rt-pcr和ngs的灵敏度较高，均可达到1％，但rt-pcr检测的融合基因靶标有限且无法检测未知融合，ngs可检测未知融合基因，但检测成本高且检测周期长。
7、例如中国专利文献cn 112143815 b(申请号202011332715.9)公开了一种用于检测人fgfr2基因融合突变的核酸组合物及检测方法，是一种实时荧光pcr(rt-pcr)检测方法：首先提取检测样本的rna并逆转录成cdna，然后再以cdna为模板采用上述试剂盒进行实时荧光pcr反应，最后根据ct值判定检测样本的阴阳性，能够同时检测18种由fgfr2驱动的融合基因。
8、又例如中国专利文献cn 112301115 b(申请号202011001862.8)公开了一种基于高通量测序的fgfrs基因突变的检测方法，包括如下步骤：共提取样本基因组dna及总rna；基因组dna进行片段化及片段化dna回收；根据总rna质控情况进行总rna打断和/或引物杂交；合成cdna第一链；合成cdna第二链；将片段化后的dna与cdna混合构建混合文库；采用捕获探针进行杂交和捕获；捕获后文库扩增及纯化；高通量测序及突变分析。
9、数字pcr(digital pcr，dpcr)是一种新兴的绝对定量技术，其通过对样本进行微小单元化处理，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，极大提高检测的精确性和灵敏度，是适用于融合基因检测的有效检测手段。但常规的dpcr检测存在与rt-pcr相同的局限性，即检测靶标有限，无法检测未知融合。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是当前利用数字pcr检测融合基因的常规方法仅能检测已知融合，且检测靶标有限的问题；提供一种有效突破检测靶标有限问题的利用数字pcr检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的方法，并提供检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的核酸组合。
2、实现本专利技术第一目的的技术方案是一种用于检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的核酸组合，包括以下引物和探针序列：
3、反转录引物uni-n6，其中uni序列为任一人工合成的固定序列，n代表随机引物。作为可选的，uni序列的最后一个碱基为a。
4、universal primer f引物，universal primer f引物为与反转录引物uni-n6的uni序列相同或部分相同的一段序列。
5、gsp primer-r-tail引物，其中gsp primer-r引物为fgfr2转录本的1-17号外显子上的一段序列，tail为与fgfr2 wt exon18靠近断点的一段序列互补的序列。tail具体序列可以调整，关键是序列位于fgfr2 exon18上靠近exon17的部分，位于断点和wt probe之间；也可以加修饰以增加亲和性，比如锁核苷酸lna或者硫代修饰s等。
6、fusion probe探针，fusion probe探针为fgfr2转录本的1-17号外显子上的一段序列。
7、wtprobe探针，wtprobe探针为fgfr2转录本18号外显子上的任意一段序列。
8、fusion probe序列的5'端带有荧光基团修饰，wtprobe序列的5'端带有荧光基团修饰，且fusionprobe和wtprobe序列的5'端荧光基团不相同。
9、fusionprobe序列3'端带有淬灭基团修饰，wtprobe序列3'端带有淬灭基团修饰。
10、上述各引物或探针序列的长度大于等于8碱基。
11、所述gsp primer-r和fusion probe为fgfr2转录本的1-17号外显子上的两段不同序列，且在cdna模板上，fusionprobe探针处于gsp primer-r引物位置的上游区域。
12、作为可选的，fusionprobe序列的5'端的荧光基团为fam、hex、vic、tet、rox、tamra、joe、cy3、cy5、cyc5.5荧光基团中的一种；wtprobe序列的5'端的荧光基团为fam、hex、vic、tet、rox、tamra、joe、cy3、cy5、cyc5.5荧光基团中的一种。
13、作为可选的，fusion probe序列的3'端基团为bhq1、bhq2、bhq3、nfq、dabcyl、eclipse淬灭基团和mgb中的一种；wtprobe序列的3'端基团为bhq1、bhq2、bhq3、nfq、da本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的核酸组合，包括以下引物和探针序列：
2.根据权利要求1所述的用于检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的核酸组合，其特征在于：反转录引物Uni-N6中Uni序列的最后一个碱基为A。
3.根据权利要求1所述的用于检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的核酸组合，其特征在于：GSPprimer-R和Fusionprobe为FGFR2转录本的1-17号外显子上的两段不同序列，且在cDNA模板上，Fusionprobe探针处于GSPprimer-R引物位置的上游区域。
4.根据权利要求1所述的用于检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的核酸组合，其特征在于：Fusion probe序列的5'端的荧光基团为FAM、HEX、VIC、TET、ROX、TAMRA、JOE、Cy3、Cy5、Cyc5.5荧光基团中的一种；WTprobe序列的5'端的荧光基团为FAM、HEX、VIC、TET、ROX、TAMRA、JOE、Cy3、Cy5、Cyc5.5荧光基团中的一种；
5.根据权利要求1至4之一所述的用于检测胆管癌中FGF
6.根据权利要求1所述的用于检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的核酸组合，其特征在于：反转录引物Uni-N6的基因序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.15，其中N代表随机引物；
7.一种利用权利要求1至6之一的核酸组合检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的方法，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的方法，其特征在于：提取的RNA中含mRNA。
9.根据权利要求7所述的检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的方法，其特征在于：RNA反转录为cDNA时，先加热RNA使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却；在冰上配制反转录反应混合液，反转录反应混合液包括反转录缓冲液、反转录酶、Uni-N6 primer、RNA模板和无酶水。
10.根据权利要求7所述的检测胆管癌中FGFR2基因融合突变的方法，其特征在于数字PCR阶段包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的核酸组合，包括以下引物和探针序列：
2.根据权利要求1所述的用于检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的核酸组合，其特征在于：反转录引物uni-n6中uni序列的最后一个碱基为a。
3.根据权利要求1所述的用于检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的核酸组合，其特征在于：gspprimer-r和fusionprobe为fgfr2转录本的1-17号外显子上的两段不同序列，且在cdna模板上，fusionprobe探针处于gspprimer-r引物位置的上游区域。
4.根据权利要求1所述的用于检测胆管癌中fgfr2基因融合突变的核酸组合，其特征在于：fusion probe序列的5'端的荧光基团为fam、hex、vic、tet、rox、tamra、joe、cy3、cy5、cyc5.5荧光基团中的一种；wtprobe序列的5'端的荧光基团为fam、hex、vic、tet、rox、tamra、joe、cy3、cy5、cyc5.5荧光基团中的一种；
5.根据权利要求1至4之一...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘秋云，陈昌岳，方国伟，
申请(专利权)人：上海兰卫医学检验所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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