【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、调节性t细胞具有治疗疾病诸如自身免疫疾病的潜力，因为它们可以靶向特定的患病细胞类型。调节性t细胞可用于例如通过抗原特异性机制产生对与感兴趣的疾病相关联的某些细胞类型和组织具有特异性的局部免疫应答。然而，稳定的抗原特异性调节性t细胞的稳健临床规模和临床级制造一直具有挑战性。因此，需要制造此类调节性t细胞的新方法。
技术实现思路
1、一些方面提供了一种包含调节性t细胞(也称为treg)的分离的细胞群体，其中：该分离的细胞群体的调节性t细胞包含稳定的调节性t细胞，这些稳定的调节性t细胞(a)包含特异性结合与主要组织相容性复合物(mhc)复合的靶肽的外源人t细胞受体(tcr)(也称为tcr-pmhc)，并且(b)包含内源foxp3基因座处的低甲基化调节性t细胞特异性脱甲基化区域(tsdr)，该分离的细胞群体的至少80％的细胞是cd25+/高cd4+cd127-/lo调节性t细胞，并且该分离的细胞群体的少于10％的细胞表达来自工程化foxp3基因座的foxp3蛋白。靶肽通常是特异性抗原肽(激动剂)，因为它触发细胞内信号传导途径，这些细胞内信号传导途径诱导t细胞介导的功能诸如细胞因子分泌和抑制活性所需的基因的表达。
2、在一些实施方案中，本公开提供了一种分离的细胞群体，其包含来源于患有自身免疫疾病的受试者的稳定的cd4+ t调节细胞(t reg)，其中至少80％的细胞是包含foxp3基因座处的低甲基化t细胞特异性脱甲基化区域(tsdr)的稳定的cd4+ t reg，
3、在一些实施方案中，稳定的cd4+ t reg不表达来自工程化foxp3基因座的foxp3蛋白。在一些实施方案中，tsdr是foxp3的cns2区域。在一些实施方案中，mhc是mhc i类或mhcii类。
4、在一些实施方案中，至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的细胞是包含内源foxp3基因座处的低甲基化tsdr的稳定的cd4+ t reg。
5、在一些实施方案中，至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的细胞是cd4+cd25+cd127-/lo。在一些实施方案中，至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的细胞是cd4+cd25+cd127-/lofoxp3+。
6、在一些实施方案中，该群体包含至少4×107个稳定的cd4+ t reg。在一些实施方案中，该群体包含4×107至1×1010个稳定的cd4+ t reg。
7、在一些实施方案中，分离的群体中少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％或少于0.01％的细胞是常规cd4+ t细胞。在一些实施方案中，少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％的常规t细胞包含外源人tcr。在一些实施方案中，分离的群体中稳定的cd4+ treg与常规t细胞的比率为至少50:1、至少60:1、至少70:1、至少80:1、至少90:1、至少100:1、至少500:1、至少1000:1或至少10000:1。在一些实施方案中，分离的群体的少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％或少于0.01％的细胞是cd8+ t细胞。在一些实施方案中，分离的群体不包含通过荧光活化细胞分选(facs)可检测百分比的cd8+ t细胞。
8、在一些实施方案中，至少10％的细胞表达外源人tcr。在一些实施方案中，至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的细胞表达外源人tcr。
9、在一些实施方案中，在冷冻保存冻融循环后，包含foxp3基因座处的低甲基化tsdr的稳定的cd4+ t reg的百分比降低10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少。
10、在一些实施方案中，稳定的cd4+ treg表现出选自以下的一种或多种功能：调节性细胞因子分泌活性；与调节性t细胞相关联的活化标志物的表达；和/或抑制活性。
11、在一些实施方案中，外源人tcr包含对tcrα链恒定区和tcrβ链恒定区中的半胱氨酸残基的一个或多个氨基酸取代，并且其中这些半胱氨酸残基能够形成一个或多个二硫键。在一些实施方案中，相对于包含seq id no:1的氨基酸序列的tcrα链恒定区，tcrα链恒定区包含t48c氨基酸取代，并且其中相对于包含seq id no:3的氨基酸序列的tcrβ链恒定区，tcrβ链恒定区包含s57c氨基酸取代。
12、在一些实施方案中，本公开提供了产生包含稳定的cd4+ t调节细胞(t reg)的细胞群体的方法，其包括：(a)从自患有自身免疫疾病的受试者获得的生物样品中去除cd8+细胞、cd19+细胞和任选的cd14+细胞，以产生耗竭的生物样品；(b)富集耗竭的生物样品中的cd25+细胞，以产生富集群体；(c)从富集群体中分离cd4+cd25+cd127-/lo细胞；(d)扩增富集群体，以产生扩增的富集细胞群体；以及(e)定量细胞群体中foxp3基因座处的t细胞特异性脱甲基化区域(tsdr)的甲基化状态，其中至少80％的细胞是包含foxp3基因座处的低甲基化tsdr的稳定的cd4+ t reg，从而产生包含稳定的cd4+ t reg的细胞群体。
13、在一些实施方案中，至少85％、至少90％或至少95％的细胞是包含foxp3基因座处的低甲基化tsdr的稳定的cd4+ t reg。在一些实施方案中，如果包含foxp3基因座处的低甲基化tsdr的细胞的百分比为80％或更大，则选择分离的群体用于治疗用途。
14、在一些实施方案中，步骤(c)进行至少两次。在一些实施方案中，该方法还包括活化步骤(c)的细胞群体。
15、在一些实施方案中，活化包括用抗cd3抗体和抗cd28抗体培养细胞群体。在一些实施方案中，第二活化步骤在第一活化步骤后4天和8天之间进行。在一些实施方案中，将细胞在包含il-2和tnfα的培养基中扩增。在一些实施方案中，活化和扩增包括将细胞群体培养至少5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。在一些实施方案中，活化和扩增包括将细胞群体培养不超过15天、14天、13天或12天。
16、在一些实施方案中，本公开提供了一种产生包含工程化稳定的cd4+ t reg的细胞群体的方法，其包括：(a)从自患有自身免疫疾病的受试者获得的生物样品中去除cd8+细胞、cd19+细胞和任选的cd14+细胞，以产生耗竭的生物样品；(b)富集耗竭的生物样品中的cd25+细胞，以产生富集群体；(c)从富集群体中分离cd4+cd25+cd127-/lo细胞；(d)将包含本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的细胞群体，其包含来源于患有自身免疫疾病的受试者的稳定的CD4+T调节细胞(T reg)，
2.根据权利要求1所述的分离的群体，其中所述稳定的CD4+T reg不表达来自工程化FOXP3基因座的FOXP3蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的分离的群体，其中所述TSDR是FOXP3的CNS2区域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的群体，其中所述MHC是MHC I类或MHC II类。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的群体，其中至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的所述细胞是包含内源FOXP3基因座处的低甲基化TSDR的稳定的CD4+T reg。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD4+CD25+CD127-/lo。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD4+CD25+CD127-/loFO
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其包含至少4×107个稳定的CD4+Treg。
9.根据权利要求8所述的分离的群体，其包含4×107个至1×1010个稳定的CD4+T reg。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述分离的群体中少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％或少于0.01％的所述细胞是常规CD4+T细胞。
11.根据权利要求10所述的分离的群体，其中少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％的所述常规T细胞包含所述外源人TCR。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述分离的群体中稳定的CD4+T reg与常规T细胞的比率为至少50:1、至少60:1、至少70:1、至少80:1、至少90:1、至少100:1、至少500:1、至少1000:1或至少10000:1。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述分离的群体的少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％或少于0.01％的所述细胞是CD8+T细胞。
14.根据权利要求13所述的分离的群体，其中所述分离的群体不包含通过荧光活化细胞分选(FACS)可检测百分比的CD8+T细胞。
15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中至少10％的所述细胞表达所述外源人TCR。
16.根据权利要求15所述的分离的群体，其中至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述细胞表达所述外源人TCR。
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中在冷冻保存冻融循环后，包含所述FOXP3基因座处的低甲基化TSDR的稳定的CD4+T reg的百分比降低10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少。
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述稳定的CD4+Treg表现出选自以下的一种或多种功能：
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述外源人TCR包含对TCRα链恒定区和TCRβ链恒定区中的半胱氨酸残基的一个或多个氨基酸取代，并且其中所述半胱氨酸残基能够形成一个或多个二硫键。
20.根据权利要求19所述的分离的群体，其中相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的TCRα链恒定区，所述TCRα链恒定区包含T48C氨基酸取代，并且其中相对于包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的TCRβ链恒定区，所述TCRβ链恒定区包含S57C氨基酸取代。
21.一种产生包含稳定的CD4+T调节细胞(T reg)的细胞群体的方法，其包括：
22.根据权利要求21所述的方法，其中至少85％、至少90％或至少95％的所述细胞是包含所述FOXP3基因座处的低甲基化TSDR的稳定的CD4+T reg。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中如果包含所述FOXP3基因座处的低甲基化TSDR的细胞的百分比为80％或更大，则选择所分离的群体用于治疗用途。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中步骤(c)进行至少两次。
25.根据权利要求21...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种分离的细胞群体，其包含来源于患有自身免疫疾病的受试者的稳定的cd4+t调节细胞(t reg)，
2.根据权利要求1所述的分离的群体，其中所述稳定的cd4+t reg不表达来自工程化foxp3基因座的foxp3蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的分离的群体，其中所述tsdr是foxp3的cns2区域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的群体，其中所述mhc是mhc i类或mhc ii类。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的群体，其中至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的所述细胞是包含内源foxp3基因座处的低甲基化tsdr的稳定的cd4+t reg。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的所述细胞是cd4+cd25+cd127-/lo。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的所述细胞是cd4+cd25+cd127-/lofoxp3+。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其包含至少4×107个稳定的cd4+treg。
9.根据权利要求8所述的分离的群体，其包含4×107个至1×1010个稳定的cd4+t reg。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述分离的群体中少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％或少于0.01％的所述细胞是常规cd4+t细胞。
11.根据权利要求10所述的分离的群体，其中少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％的所述常规t细胞包含所述外源人tcr。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述分离的群体中稳定的cd4+t reg与常规t细胞的比率为至少50:1、至少60:1、至少70:1、至少80:1、至少90:1、至少100:1、至少500:1、至少1000:1或至少10000:1。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述分离的群体的少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％或少于0.01％的所述细胞是cd8+t细胞。
14.根据权利要求13所述的分离的群体，其中所述分离的群体不包含通过荧光活化细胞分选(facs)可检测百分比的cd8+t细胞。
15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中至少10％的所述细胞表达所述外源人tcr。
16.根据权利要求15所述的分离的群体，其中至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述细胞表达所述外源人tcr。
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中在冷冻保存冻融循环后，包含所述foxp3基因座处的低甲基化tsdr的稳定的cd4+t reg的百分比降低10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少。
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述稳定的cd4+treg表现出选自以下的一种或多种功能：
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离的群体，其中所述外源人tcr包含对tcrα链恒定区和tcrβ链恒定区中的半胱氨酸残基的一个或多个氨基酸取代，并且其中所述半胱氨酸残基能够形成一个或多个二硫键。
20.根据权利要求19所述的分离的群体，其中相对于包含seq id no:1的氨基酸序列的tcrα链恒定区，所述tcrα链恒定区包含t48c氨基酸取代，并且其中相对于包含seq id no:3的氨基酸序列的tcrβ链恒定区，所述tcrβ链恒定区包含s57c氨基酸取代。
21.一种产生包含稳定的cd4+t调节细胞(t reg)的细胞群体的方法，其包括：
22.根据权利要求21所述的方法，其中至少85％、至少90％或至少95％的所述细胞是包含所述foxp3基因座处的低甲基化tsdr的稳定的cd4+t reg。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中如果包含所述foxp3基因座处的低甲基化tsdr的细胞的百分比为80％或更大，则选择所分离的群体用于治疗用途。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中步骤(c)进行至少两次。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其还包括活化步骤(c)的细胞群体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述活化包括用抗cd3抗体和抗cd28抗体培养所述细胞群体。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中第二活化步骤在第一活化步骤后4天和8天之间进行。
28.根据权利要求27所述的方法，其中将所述细胞在包含il-2和tnfα的培养基中扩增。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述活化和扩增包括将所述细胞群体培养至少5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述活化和扩增包括将所述细胞群体培养不超过15天、14天、13天或12天。
31.一种产生包含工程化稳定的cd4+t reg的细胞群体的方法，其包括：
32.根据权利要求31所述的方法，其中至少85％、至少90％或至少95％...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·索芬，A·范艾尔萨斯，R·兰索霍夫，D·莫德利，张彦波，J·德里杰福斯，E·安季波夫，H·阿多尼，夏方，E·科苏比卡，C·斯特兰奇，
申请(专利权)人：阿巴塔治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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