【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于协同作用的微量样品细胞外囊泡富集方法。利用微流控芯片上实现微量样本的分析，利用双重亲和分子实现细胞外囊泡的高效富集。
技术介绍
1、细胞外囊泡(evs)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，携带着来自母体细胞丰富的蛋白质、核酸、脂质等物质信息，参与细胞通讯、免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤侵袭等生理病理过程，广泛存在于血液、尿液、唾液、泪液、乳液、脑脊液等多种生物体液中(r.kalluri,et al.science,2020,367,6478)。在过去的几年里，evs作为诊断和治疗的生物标志物引起了人们的极大兴趣，evs含量反映了不同疾病患者的特定病理生理状态，并代表了追踪许多疾病进展的生物标志物(r.kalluri,et al.cell,2023,186,8)。
2、然而，由于其生物发生、物理性质和分子成分的异质性，evs的分离富集仍然极具挑战性。传统的超速离心法、聚合物沉降法、超滤法等evs分离方法具有样本需求量大、evs产量和纯度不高、耗时耗力等缺陷，不适于临床珍贵生物样本的分析(he yan,etal.anal.chem.2021 93 11,4739-4774)。
3、亲和分离法在高效分离高纯度evs方面发展迅速，传统的亲和分离法通常利用抗体-抗原亲和、静电吸附等亲和作用实现evs的分离(huilin shao,et al.chemicalreviews,2018,118,4,1917-1950)。但由于evs高度的异质性，这种单一的亲和作用往往只针对某一类evs
4、微流控芯片技术是一种通用技术，应用于从诊断到纳米技术的广泛领域。与传统的分离技术相比，基于微流控芯片的evs分离技术因其简单性、样本需求量少以及高灵敏度、特异性、空间和时间分辨率而受到关注，越来越多的应用于evs的分离富集。
5、因此，基于微流控芯片处理微量样本的优势，基于双重亲和作用，实现了微量样本中细胞外囊泡的高效富集，具有样本需求量少、分离速度快、分离产率和纯度高等优点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于协同作用的微量样品细胞外囊泡富集方法，该方法具有需求样本量少、分离速度快、操作简便、分离纯度高、分离产率高等优点，规避了现有技术操作步骤繁琐、分离纯度和产率不高的缺陷。
2、本专利技术提供了一种基于协同作用的微量样品细胞外囊泡富集方法，该方法通过在微流控芯片通道表面修饰对细胞外囊泡具有亲和作用的脂质分子和四价钛离子(ti4+)的双重亲和分子，实现微量样品中细胞外囊泡的高效富集。
3、具体步骤如下：
4、(1)芯片制备：采用软光刻技术制备pdms芯片，包括上层的直通道液路层和下层的y型微柱阵列液路层，设置有进样口、出样口和微流通道区。将预聚物浇筑到su-8模具上，放入恒温干燥箱中80℃静置固化，将固化后的芯片与模具分离，采用手持打孔器在芯片上打出进样孔、出样孔和定位孔。
5、(2)芯片修饰：利用等离子清洗机处理芯片表面30-60秒，将芯片浸入5-10％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)溶液中反应30-60min，反应后的表面利用无水乙醇和去离子水清洗干净，用清洁空气或氮气吹干后，对准定位孔闭合芯片，并在恒温干燥箱中130℃静置固定30-60min。将3-磷酸丙酸，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)按摩尔比为1：1.5-2：0.8-1溶于pbs缓冲液(ph＝7.2-7.4)，，振荡反应20-40min，然后加入终浓度为5-10mg/ml脂质分子超声溶解，将上述液体通入芯片，反应6-12h。反应完毕后，通入水清洗残余反应液后，通入质量浓度0.1-0.5g/ml硫酸钛水溶液，反应1-2小时。
6、(3)细胞外囊泡分离：利用进样针吸取生物液体，将进样针安装到注射泵上，利用注射泵以5-10μl/min流速将待测液体通入微流控芯片，室温孵育5分钟-2小时；泵入空气去除多余液体，利用pbs缓冲液洗去通道内的非特异性吸附后，泵入ph为8-10之间的碱性溶液与芯片孵育5-10min，重复2次，实现细胞外囊泡的洗脱，收集得到细胞外囊泡样品。
7、进一步的，微流控芯片材质为聚二甲基硅氧烷聚合物(pdms)，包括上层的直通道液路层和下层的y型微柱阵列液路层，设置有进样口、出样口和微流通道区。
8、对细胞外囊泡具有亲和作用的脂质分子选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)，中的一种或两种以上；四价钛离子(ti4+)对囊泡表面磷酸根具有螯合作用。
9、进一步的，所用碱性溶液包括100mm三乙胺水溶液，10％ nh3.h2o。
10、所述样品为含有细胞外囊泡的液体，包括血浆、尿液、唾液、泪液、乳液、脑脊液、细胞培养液等。
11、本专利技术具有如下优点：
12、(1)本专利技术采用的亲和分子为所有细胞外囊泡普遍共有的特征，可以无偏地富集样本中所有细胞外囊泡，与目前的特异性抗体-抗原等亲和作用相比更具有优势。
13、(2)本专利技术通过在芯片上键合双重亲和分子实现细胞外囊泡的捕获，与目前广泛发展的单一亲和作用相比，捕获效率更高，囊泡产率和纯度更高。
14、(3)本专利技术富集细胞外囊泡的效率很高，5分钟内即可实现85％的富集效率，显著节约了时间精力，有助于高通量处理临床样本。
15、(4)本专利技术通过注射泵引入样本和试剂，更加自动化，简化了人工操作；通过在微流体通道内设置y型微柱阵列，增加了样本与芯片界面的接触混合，提高了捕获效果。利用微流控芯片实现了临床微量珍贵样本的细胞外囊泡富集，为基于细胞外囊泡的临床诊断治疗提供了方案。
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1.一种基于协同作用的微量样品细胞外囊泡的富集方法，其特征在于：
2.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：对细胞外囊泡具有亲和作用的脂质分子选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)，中的一种或两种以上；四价钛离子(Ti4+)对囊泡表面磷酸根具有螯合作用。
3.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微流控芯片通道表面修饰过程包括以下步骤：
5.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：步骤(2)中3-磷酸丙酸、EDC、NHS的摩尔比为1：1.5-2：0.8-1，脂质分子的终浓度为5-10mg/ml。
6.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：利用注射泵将待测样品以5-10μl/min泵入芯片，室温孵育5分钟-2小时，实现生物样品中细胞外囊泡在芯片表面的捕获；通入PBS缓冲液(pH＝7.2-7.4)去除非特异性吸附，通入pH为8-10之间
7.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：碱性溶液包括50-100mM三乙胺水溶液，5％-10％NH3.H2O。
8.按照权利要求7所述的富集方法，其特征在于：所述样品为含有细胞外囊泡的液体，包括血浆、尿液、唾液、泪液、乳液、脑脊液、细胞培养液等。
...【技术特征摘要】
1.一种基于协同作用的微量样品细胞外囊泡的富集方法，其特征在于：
2.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：对细胞外囊泡具有亲和作用的脂质分子选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)，中的一种或两种以上；四价钛离子(ti4+)对囊泡表面磷酸根具有螯合作用。
3.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微流控芯片通道表面修饰过程包括以下步骤：
5.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：步骤(2)中3-磷酸丙酸、edc、nhs的摩...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，侯国珊，袁辉明，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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