本发明专利技术公开了一种circSamd4基因敲除小鼠模型构建方法和应用。该circSamd4基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其包括下述步骤：利用sgRNA对小鼠的circSamd4的基因进行敲除，获得circSamd4基因敲除小鼠。本发明专利技术使用Crispr‑cas9基因敲除技术，敲出了小鼠circRNA基因circSamd4，所获得小鼠均表现出明显的视网膜厚度变薄，视网膜神经节细胞(GCL)丢失，视功能损伤等青光眼表型。可以为青光眼发病机制的研究，药物和临床治疗策略的筛选提供简单、可靠、经济的动物模型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疾病动物模型构建方法，具体涉及一种circsamd4基因敲除小鼠模型构建方法和应用。
技术介绍
1、青光眼是全球首位不可逆性致盲性眼病，世界卫生组织(who)最近的统计结果显示，目前全球范围内青光眼患者约有8000万人，预计到2040年，全球青光眼患者将突破1.118亿人。青光眼不仅给个人带来了巨大的身心痛苦，而且已经成为全球重大公共卫生问题。目前青光眼的发病机制尚未完全阐述，临床缺乏有效治疗手段，且目前的研究缺乏合适的动物模型。因此建立有效的动物疾病模型对青光眼的诊断和治疗研究具有重要意义。
2、近年来的研究也认为青光眼是个多因素共同调控的神经变性疾病。随着青光眼患病人数逐年增加，加上治疗手段有限，患者预后不良等诸多问题，使得青光眼治疗成为临床临床眼科医生的巨大挑战。故而充分了解青光眼的发病机制及寻求行之有效的早期诊断和治疗方法一直是青光眼领域研究的热点和难点。
3、本专利所构建的基因敲除小鼠均出现明显的视网膜厚度变薄，视网膜神经节细胞(gcl)丢失，视功能损伤等青光眼表型。可以为青光眼发病机制的研究，药物和临床治疗策略的筛选提供简单、可靠、经济的动物模型。
4、目前采用较多的开角型青光眼模型，依据构建方式主要分为基因诱导型和操作干预型。操作干预型常用的做法是操作诱发高眼压模型，建模成功率差异大，需要专业的技术技巧，所建模型一致性不高。目前已存在的多种啮齿类动物青光眼模型都有一定的缺陷，无法完全满足目前对青光眼研究的需求，因此寻求一种新的建模方式是十分重要的。
技术实现思路
1、本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供了一种circsamd4基因敲除小鼠动物模型及其构建方法和应用。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、一种circsamd4基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其包括下述步骤：利用sgrna对鼠的circsamd4的基因进行敲除，获得circsamd4基因敲除鼠。
4、本专利技术中，sgrna是指小向导rna(single guide rna，sgrna)，是一种单链rna分子，长度约为100-200个核苷酸。sgrna是crispr/cas9基因编辑系统中的重要组成部分，包含目标序列(crrna)和一段cas9核酸酶识别序列(tracrrna)，能够引导cas9蛋白识别并切割特定的dna序列，从而实现基因编辑。
5、本专利技术一些实施例中，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、本专利技术一些实施例中，所述sgrna1和sgrna2质量比为1:1。
7、本专利技术一些实施例中，根据circsamd4基因序列，针对circsamd4基因14号染色体敲除partial intron 3，敲除环状rna下游的sine元件，预测可在不影响线性基因表达的情况下影响环状rna表达。
8、本专利技术一些实施例中，将cas9 mrna与构建的sgrna1、sgrna2共同注射到小鼠受精卵细胞核中，产生靶向敲除小鼠，即f0代小鼠。
9、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10、本专利技术中，所述cas9 mrna的作用是，在受精卵中翻译cas9蛋白，之后cas9蛋白在sgrna的引导下剪切基因组dna分子。
11、本专利技术一些实施例中，所述sgrna浓度为100pmol/μl。
12、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna翻译后的cas9蛋白浓度为250ng/μl。
13、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna与sgrna1质量比为(1-2):1。
14、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna与sgrna2质量比为(1-2):1。
15、本专利技术对鼠的来源没有特殊限定，例如可以采用常规基因敲除使用的c57bl/6j。
16、本专利技术一优选实施例中，所述circsamd4基因敲除小鼠动物模型的构建方法包括如下步骤：上述小鼠动物模型的构建方法包括如下步骤：
17、(1)构建针对circsamd4基因的sgrna；所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2所示；
18、(2)将cas9 mrna与sgrna1、sgrna2导入小鼠受精卵细胞核中，获得circsamd4基因敲除鼠，即为f0代小鼠。所述cas9 mrna的核苷酸序列如seq id no.3所示。本专利技术对鼠的来源没有特殊限定，采用常规基因敲除使用的c57bl/6j即可；
19、(3)提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增和序列分析鉴定是否为嵌合体；
20、(4)将f0代小鼠与wt小鼠交配获得f1代小鼠，经pcr鉴定纯合子即为小鼠动物模型。
21、其中，seq id no.1：cttccttcagtcttcgttcacgg
22、seq id no.2：tgtaggacctaggttgctccaggseq id no.3：
23、
24、
25、
26、本专利技术还提供一种基于crispr/cas9基因敲除技术构建circsamd4基因敲除小鼠模型的sgrna，包括sgrna1和sgrna1，所述sgrna1如seq id no:1所示，所述sgrna2如seq idno:2所示。
27、本专利技术还提供了一种circsamd4基因打靶载体，所述载体是基于crispr/cas9系统的sgrna表达载体，sgrna的作用位点的序列如seq id no:1和seq id no:2所示。
28、本专利技术还提供了一种前述的sgrna在构建青光眼相关的基因敲除小鼠动物模型中的用途。
29、本专利技术还提供了一种通过上述构建方法构建得到的circsamd4基因敲除小鼠动物模型在研究青光眼疾病机理上的应用。
30、本专利技术还提出了一种上述构建方法构建得到的circsamd4基因敲除小鼠动物模型在筛选靶向治疗青光眼的药物中的应用。
31、本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
32、本专利技术的有益效果是：
33、本专利技术使用crispr-cas9基因敲除技术，敲出了小鼠circrna基因circsamd4。所获得小鼠均表现出明显的视网膜厚度变薄，视网膜神经节细胞(gcl)丢失，视功能损伤等青光眼表型。可以为青光眼发病机制的研究，药物和临床治疗策略的筛选提供简单、可靠、经济的动物模型。
34、本专利技术所获得的基因敲除小鼠生下来不久(6-8周内)即自然表现出青光眼相关表型，造模时间短，不需要特殊的试剂、手术和物理方法，方法简单易行。小鼠可以本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种circSamd4基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，其包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA1和sgRNA2质量比为1:1。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，针对circSamd4基因14号染色体敲除Partial intron 3，敲除环状RNA下游的SINE元件。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，将Cas9 mRNA与构建的sgRNA1、sgRNA2共同注射到小鼠受精卵细胞核中，产生靶向敲除小鼠，即F0代小鼠；
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA浓度为100pmol/μL；
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA与sgRNA1质量比为(1-2):1；和/或，所述Cas9 mRNA与sgRNA2质量比为(1-2):1。
8.一种通过如权利要求1-7中任一项所述的构建方法构建得到的circSamd4基因敲除小鼠动物模型在研究青光眼疾病机理上的应用。
9.一种通过如权利要求1-7中任一项所述的构建方法构建得到的circSamd4基因敲除小鼠动物模型在筛选靶向治疗青光眼的药物中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种circsamd4基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，其包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq idno.2所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna1和sgrna2质量比为1:1。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，针对circsamd4基因14号染色体敲除partial intron 3，敲除环状rna下游的sine元件。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，将cas9 mrna与构建的s...
【专利技术属性】
技术研发人员：计丹，杨倩，游梦玲，周学智，李海波，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：
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