【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法及其应用。
技术介绍
1、源自于间充质干细胞内分泌的外泌体，富含一百多种胞外基质蛋白，mrna信使核糖核酸和多重生长因子。外泌体(exosome)是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mrna和microrna等物质。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。
2、在临床上，干细胞外泌体主要治疗烧伤、烫伤、软骨修复、皮肤溃疡、再生健康皮肤等方面。
3、二维干细胞培养方式不能长期保持干细胞原有的细胞特性，且这种培养方式不能准确描述和模拟在体内丰富的环境和复杂过程，比如信号转导、空间结构变化等。因此，用二维细胞培养法收集的数据可能对其体内应用预测具有误导性，且二维培养得到的外泌体收率较低。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法及其应用，解决了现有技术中二维培养外泌体收率低且不能准确描述和模拟在体内丰富的环境和复杂过程的问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，包括以下步骤：
3、步骤s1、对间充质干细胞进行传代培养；
4、步骤s2、制备多孔三维支架，将步骤s1中的间充质干细胞接种在多孔三维支架材料上进行培养，收集上清液；
5、步骤s3、将步骤s2中的上清液分离
6、在一些实施例中，所述步骤s1具体为：
7、步骤s11、将哺乳动物的软骨组织剥离，并进行无菌处理；
8、步骤s12、将无菌处理过后的软骨组织放入缓冲溶液中进行离心，提取间充质干细胞；
9、步骤s13、对步骤s12中的间充质干细胞进行细胞培养，待细胞达到80％后进行传代培养及冻存于干细胞冻存管备用。
10、在一些实施例中，，所述步骤s2具体为：
11、步骤s21、配置氧化石墨烯粉末水溶液和edta水溶液，将配置好的氧化石墨烯粉末水溶液和edta水溶液进行水热反应制备前驱体；
12、步骤s22、将步骤s11中的前驱体进行煅烧得到多孔三维支架材料；
13、步骤s23、对步骤s12中的多孔三维支架材料进行杀菌处理，步骤s1中的间充质干细胞接种在多孔三维支架上，加入细胞培养液进行培养，收集上清液。
14、在一些实施例中，所述缓冲溶液为柠檬酸溶液或者磷酸盐溶液。
15、在一些实施例中，所述氧化石墨烯水溶液和所述edta水溶液的浓度为0.1-10mg/ml。
16、在一些实施例中，所述水热反应的反应温度为100-180℃，反应时间为1-6h。
17、在一些实施例中，所述煅烧温度为220-800℃。
18、在一些实施例中，所述步骤s23具体为：
19、步骤s231、将备用的间充质干细胞制成1×106每毫升的单细胞悬液接种在多孔三维支架上；
20、步骤s322、加入5-15ml的dmem原代培养液，并在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养1-4h，随后静置培养，72h后再加入5-15ml的dmem原代培养液，收集上清液。
21、在一些实施例中，所述步骤s322中的上清液进行离心分离，采用孔径为0.15-0.22μm的微孔滤膜过滤死细胞、细胞碎片以及微囊泡得到含有外泌体的滤液。
22、本专利技术的另一种技术方案是这样实现的：间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法制备得到的外泌体，应用于骨关节炎。
23、与现有技术相比，本专利技术通过将间充质干细胞进行传代培养并接种至多孔三维支架材料上进行培养，本专利技术的多孔三维支架材料具有多孔性，有助于氧气、营养物质和代谢物的运输，能够促进细胞生长进而使外泌体的收率增加，且在控制和监测生长细胞的微环境参数同时借助微工程(微流控)使模拟的结果尽可能接近现实。
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1.一种间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述缓冲溶液为柠檬酸溶液或者磷酸盐溶液。
5.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述氧化石墨烯水溶液和所述EDTA水溶液的浓度为0.1-10mg/mL。
6.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述水热反应的反应温度为100-180℃，反应时间为1-6h。
7.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述煅烧温度为220-800℃。
8.根据权利要求5-7任意一项所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S23具体为：
9.根据
10.如权利要求1-9任意一项所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法制备得到的外泌体，其特征在于，应用于骨关节炎。
...【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述步骤s1具体为：
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述步骤s2具体为：
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述缓冲溶液为柠檬酸溶液或者磷酸盐溶液。
5.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在于，所述氧化石墨烯水溶液和所述edta水溶液的浓度为0.1-10mg/ml。
6.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的三维细胞培养方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文翠，邓志钦，刘建全，陈小强，赵喆，王光辉，李永胜，李嘉贝，程翔宇，尹建文，罗婉婷，魏宝婷，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院深圳市转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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