【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及适配体，具体涉及一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体及其筛选方法和应用，用于茉莉酸甲酯检测。
技术介绍
1、茉莉酸甲酯(meja)是茉莉酸(ja)的甲基化衍生物，作为一种重要的植物激素，与其他植物激素一同调控植物的一系列生理过程，尤其是在应对各种环境胁迫方面，meja显著增强了植物在逆境的适应性和抗性。meja除了在植物体内可以作为信号分子，还可以通过气孔挥发到空气中以实现植物与植物之间、植物与草食动物之间的信息传递。meja还可以作为有效的抗菌剂、食品防腐剂、抗氧化剂用于农业生产、存储和运输中。由于茉莉酸甲酯重要的生理效应和在植物体中相对低的含量，茉莉酸甲酯的检测越来越受到重视。
2、目前关于meja的定量检测方法包括酶联免疫吸附法(elisa)、液相色谱–串联质谱法(lc–ms/ms)、气相色谱-质谱法(gc-ms)、荧光法(ce-lif)、高效液相色谱法(hplc)等。这需要严格且繁琐的预处理，且操作复杂、需要专业的人士操作、仪器昂贵等缺点，不能应用于大规模普及和现场的高效检测。
3、适配体是指通过指数富集配体系统(selex)从随机单链文库中筛选得到的具有高亲和力、特异性强的单链dna或rna。适配体包含两端引物区和中间随机序列，大多含有15-100个寡核苷酸，可以通过氢键、范德华力、疏水作用、静电作用等相互作用下折叠成不同的二级、三级结构，以与靶标分子结合。适配体可以进行体外筛选、且易于进行化学修饰、热稳定好。基于适配体的传感分析方法有望成为检测茉莉酸甲酯含量的重要手段。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体及其筛选方法，以茉莉酸甲酯为靶标，水杨酸、吲哚乙酸为反筛分子，采用capture-selex进行茉莉酸甲酯植物激素适配体的筛选，以获得高亲和力、强特异性的适配体meja-52。
2、本专利技术还有一个目的在于提供一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体的应用，用于茉莉酸甲酯的快速检测。
3、本专利技术具体技术方案如下：
4、一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体，为meja-52，所述meja-52的序列为：
5、ggacgacggcagtttgcgactagcgtatgactgacgctgtcgtcc；其序列如seq id no:1所示。
6、本专利技术提供的一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体的筛选方法，包含以下步骤：
7、1)适配体的筛选：将初始ssdna文库与生物素化捕获探针加热退火处理，冷却至室温，与链霉亲和素磁珠孵育，加入靶标茉莉酸甲酯孵育，磁分离取上清液，作为pcr扩增的模板；
8、2)pcr扩增；
9、3)制备次级ssdna，作为下一轮的初始文库；
10、4)进行循环筛选，获得特异性识别茉莉酸甲酯的适配体。
11、步骤1)中，所采用的初始文库为72nt的单链寡核苷酸，包括上、下游引物和中间30个随机核苷酸序列。
12、步骤1)中，以茉莉酸甲酯为正筛靶标，以水杨酸、吲哚乙酸为反筛靶标，磁分离去除与反筛靶标结合的ssdna,以提高适配体的特异性。
13、步骤2)中pcr扩增体系为：正向引物:2.5μl(10μm)、生物素化反向引物:2.5μl(10μm)、5μl 10×pcr buffer、4μl dntp(each 2.5mm)、0.25μl takara taq hs(5u/μl)、30.75μl无菌水、5μl ssdna。
14、步骤2)中pcr程序为：98℃,30s,n循环[98℃,10s；59℃,15s；72℃,20s],72℃,2min；循环数n由10％page凝胶电泳验证。
15、步骤3)中次级ssdna的制备，将pcr产物与链霉亲和素磁珠孵育结合，naoh溶液解离双链dna，收取上清液并用hcl中和，作为下一轮的初始文库。
16、步骤4)中将次级文库投入下一轮的筛选，使亲和力高的适配体不断地被富集，直至筛选出目标适配体。
17、将最后一轮的pcr产物进行高通量测序、亲和力分析、特异性验证，特异性识别茉莉酸甲酯的适配体。
18、利用sgi荧光法，通过多功能酶标仪测量其荧光值以测定筛选序列的解离常数，从而对适配体序列进行亲和力和特异性分析。通过圆二色谱和分子对接模拟对适配体结合茉莉酸甲酯前后构象变化进行分析，明确其结合机制和主要的结合位点。
19、本专利技术提供的一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体的应用，用于茉莉酸甲酯检测。
20、检测方法为：fam荧光染料标记的适配体meja-52在使用前进行95℃退火处理,然后适配体meja-52与不同浓度的meja溶液混合均匀，在37℃避光孵育60min，然后向混合液中加入fe-mof到每个反应液中孵育15min；最后，使用荧光分光光度计测定荧光强度，每组实验平行测定三次，计算实验组与对照组的荧光强度比值f/f0，并以荧光强度比值为纵坐标，meja浓度为横坐标绘制标准曲线，利用标准曲线实现茉莉酸甲酯的检测。
21、本专利技术提供采用capture-selex,以茉莉酸甲酯为靶标，水杨酸、吲哚乙酸为反筛分子，采用capture-selex进行茉莉酸甲酯植物激素适配体的筛选，以获得高亲和力、强特异性的适配体meja-52。以筛选的适配体为新型的识别元件构建生物传感器，可实现植物中茉莉酸甲酯的同步检测。操作简单、不需要使用昂贵的仪器，能应用于大规模普及和现场的高效检测。
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1.一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体，其特征在于，所述特异性识别茉莉酸甲酯的适配体为MeJA-52，所述MeJA-52的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述的特异性识别茉莉酸甲酯的适配体的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，所采用的初始文库为72nt的单链寡核苷酸，包括上、下游引物和中间30个随机核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，以茉莉酸甲酯为正筛靶标，以水杨酸、吲哚乙酸为反筛靶标。
5.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增体系为：正向引物:2.5μL(10μM)、生物素化反向引物:2.5μL(10μM)、5μL 10×PCR Buffer、4μL dNTP(each2.5mM)、0.25μL TaKaRa Taq HS(5U/μl)、30.75μL无菌水、5μL ssDNA。
6.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中PCR程序为：98℃
7.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中次级ssDNA的制备，将PCR产物与链霉亲和素磁珠孵育结合，NaOH溶液解离双链DNA，收取上清液并用HCl中和，作为下一轮的初始文库。
8.一种权利要求1所述的特异性识别茉莉酸甲酯的适配体的应用，其特征在于，用于茉莉酸甲酯检测。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，检测方法为：FAM荧光染料标记的适配体MeJA-52在使用前进行95℃退火处理,然后适配体MeJA-52与不同浓度的MeJA溶液混合均匀，在37℃避光孵育60min，然后向混合液中加入Fe-MOF到每个反应液中孵育15min；最后，使用荧光分光光度计测定荧光强度，每组实验平行测定三次，计算实验组与对照组的荧光强度比值F/F0，并以荧光强度比值为纵坐标，MeJA浓度为横坐标绘制标准曲线，利用标准曲线实现茉莉酸甲酯的检测。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性识别茉莉酸甲酯的适配体，其特征在于，所述特异性识别茉莉酸甲酯的适配体为meja-52，所述meja-52的序列如seq id no:1所示。
2.一种权利要求1所述的特异性识别茉莉酸甲酯的适配体的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，所采用的初始文库为72nt的单链寡核苷酸，包括上、下游引物和中间30个随机核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，以茉莉酸甲酯为正筛靶标，以水杨酸、吲哚乙酸为反筛靶标。
5.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中pcr扩增体系为：正向引物:2.5μl(10μm)、生物素化反向引物:2.5μl(10μm)、5μl 10×pcr buffer、4μl dntp(each2.5mm)、0.25μl takara taq hs(5u/μl)、30.75μl无菌水、5μl ssdna。
6.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特...
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