【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种基于rca-fish的特定细胞群分析和筛选的方法及其应用。
技术介绍
1、流式-荧光原位杂交技术(flow-fish)将流式细胞术与荧光原位杂交结合在一起，同时对细胞内的rna和表面抗原表达情况进行高通量，多参数的分析，可以同时分析多细胞的复杂细胞表型。流式细胞分析中使用的抗体对特定的免疫细胞表面标记物具有高度特异性。在过去，由于免疫细胞表型的复杂性和免疫细胞特定标记物的有限性，非模式动物有效抗体稀缺。flow-fish技术可以弥补抗体的缺少或者应用受限的问题，同时不受物种组织的限制，可以基于rna水平上进行分析，包含非编码rna，具有通量大，探针设计简单，并且可以进行多重检测。目前主流的flow-fish技术有利用单探针或多探针的单分子流式fish，但是由于探针限制，背景强，信号放大有限，对表达水平低的基因并不友好，检测灵敏度低。而基于滚环扩增(rolling circle amplification，rca)杂交信号放大的特定细胞群分析/分选技术，具有探针制备简单，检测效率高，特异性强，信号放大强的特点，弥补了传统flow-fish的不足。
2、流式细胞检测技术(flow cytometry)是基于细胞表面特异性标志物对各细胞亚型进行鉴定的技术。其灵敏度高，特异性强，操作简单，可同时对标本中各细胞亚型进行实时鉴定。流式细胞术已广泛应用于各研究领域，具有检测速度快、准确性高、通量高、操作流程自动化及数据分析智能化等显著优势。每个样品分析的细胞数量多、样品体积小、高通量、可用于检
3、与基于抗体的流式相比，flow-fish允许同时检测mrna和细胞表面标志物，可以克服流式抗体的限制，通过mrna动态变化来指征基因表达变化。fish-flow技术可以将fish技术的一部分自动化，对悬浮液中的细胞进行定量分析。它可以标记抗体无法做到的非编码rna，可视化和定量单个细胞。还可以在不改变细胞形态的情况下检查核苷酸序列。由于flow-fish作为一种高通量方法的优势，该技术已成功地应用于临床，环境和食品微生物学。此外，flow-fish还允许通过使用适用于流式细胞术的(标记的)抗体，将rna测量与(标记的)探针或探针组、蛋白质测量相结合，从而对细胞进行深入的表型分析。同时，与适合flow-fish的抗体偶联的荧光染料存在一些限制，与普通基于显微镜的fish相比，多色流式细胞术允许更高程度的复用，从而允许进行更深入的表征。
4、用于检测微生物遗传信息的最常用类型的flow-fish测定之一是单探针flow-fish。该方法适用于检测dna、microrna和(m)rna。由于仅使用一种探针，单探针flow-fish需要对靶基因的高序列特异性和探针亲和力。通常，锁核酸(lna)和肽核酸(pna)用于这种类型的flow-fish测定。lna和pna探针允许更高的杂交温度，增强探针特异性。单分子flow-fish探针是利用多探针的20个核苷酸长的单链寡(dna)核苷酸，适合于检测微小rna和(m)rna。这些针对目标靶标或微生物定制设计的探针组可以直接在5’或3’末端标记，也可以在内部定制标记，以根据研究者的需求纳入已建立的流式细胞术组中。但是，该方法不能进行信号放大，这限制了低表达基因的检测，其次，对于短序列的转录本没有足够的把表空间与探针杂交，最后由于单分子探针不能有效避免非特异性结合，信噪比较低。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于rca-fish的特定细胞群分析和筛选的方法及其应用。本专利技术的方法将初级杂交探针特异性杂交到悬浮细胞内的多个转录本上；通过滚环扩增的方式原位放大每个转录本携带的barcode信息；再使用标记有barcode对应荧光分子的荧光探针对不同细胞进行荧光标记；最后，依靠流式细胞仪系统对复杂样本进行分析或者分选。与目前已有的flow-fish技术相比，本专利技术具有成本低，杂交效率高，特异性强的特点。
2、为实现上述目的，本专利技术所设计的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种基于rca-fish的特定细胞群分析和筛选的方法，包括以下步骤：
4、(1)初级探针的设计与制备
5、从待检测rna序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无rna高级结构的靶序列区域设计杂交初级探针；所述初级探针由锁式探针和rca引发探针组成；
6、(2)探针预处理
7、对初级探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；再将5’端磷酸化修饰的锁式探针与rca引发探针进行梯度退火；
8、(3)初级探针杂交
9、用多聚甲醛对组织进行固定，然后用甲醛和胃蛋白酶先后对组织进行通透处理，配制含有初级探针的杂交缓冲液，加入到反应腔室中进行过夜杂交；
10、(4)探针环化连接反应
11、离心去除上一步的杂交缓冲液，彻底清洗后，将连接酶反应体系加入到富集样本中进行连接反应，使锁式探针与对应rna上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；
12、(5)滚环扩增放大信号
13、聚合酶以rca引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，进一步放大信号(rca引发探针同时与rna上的靶序列和锁式探针互补)；
14、(6)荧光探针标记细胞
15、合成所需荧光分子标记好的二级探针，即为荧光探针；
16、将荧光探针与步骤(5)放大信号后的样品孵育(使细胞标记上荧光)，过细胞筛，稀释，即用于流式细胞分析/分选；
17、(7)如何分析和分选
18、将细胞用pbs/0.1％ bsa洗涤两次，重悬于pbs/0.1％ bsa中，并在贝克曼公司的流式细胞术核心设施的cytoflex-lxcytoflex-lx上采集；使用flowjo v10.8.0和cytexpert内，首先手动门控数据以去除碎片和聚集体；进行umap，然后进行flowsom以可视化和聚类数据。
19、进一步地，所述步骤(1)中，待检测rna序列的靶序列由3段连续的靶序列a、b和c组成，且所述锁式探针由5’端至3’端为a’序列，loop序列和b’序列，所述a’序列和b’序列分别与靶序列a、靶序列b互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；rca引发探针由2段序列组成，一段为与靶序列互补的区域，另一段与锁式探针上中间区域互补，形成滚环扩增的引物。
20、再进一步地，所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成，barcode序列为两个barcode序列的总称，分别为barcode1序列和ba本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于RCA-FISH的细胞群分析和筛选的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，待检测RNA序列的靶序列由3段连续的靶序列A、b和C组成，且所述锁式探针由5’端至3’端为A’序列，loop序列和b’序列，所述A’序列和b’序列分别与靶序列A、靶序列b互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；RCA引发探针由2段序列组成，一段为与靶序列互补的区域，另一段与锁式探针上中间区域互补，形成滚环扩增的引物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成，barcode序列为两个barcode序列的总称，分别为barcode1序列和barcode2序列；barcode序列与荧光探针互补。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为T4多聚核苷酸激酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，含有初级探针的杂交缓冲液体系中各组分浓度如下：10％
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，连接酶反应体系的连接酶为SplinTR连接酶；
7.一种如权利要求1所述基于RCA-FISH的细胞群分析和筛选的方法在针对悬浮细胞的mRNA的流式分析中的应用。
8.一种如权利要求1所述基于RCA-FISH的细胞群分析和筛选的方法在检测感染不同腺相关病毒的293T细胞的流式分析中的应用。
9.一种如权利要求1所述基于RCA-FISH的细胞群分析和筛选的方法在检测脑的前额叶和海马区组织中特定细胞群的流式分析中的应用。
10.一种如权利要求1所述基于RCA-FISH的细胞群分析和筛选的方法在检测猪血PBMC中特定免疫细胞群的流式分析中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于rca-fish的细胞群分析和筛选的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，待检测rna序列的靶序列由3段连续的靶序列a、b和c组成，且所述锁式探针由5’端至3’端为a’序列，loop序列和b’序列，所述a’序列和b’序列分别与靶序列a、靶序列b互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；rca引发探针由2段序列组成，一段为与靶序列互补的区域，另一段与锁式探针上中间区域互补，形成滚环扩增的引物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成，barcode序列为两个barcode序列的总称，分别为barcode1序列和barcode2序列；barcode序列与荧光探针互补。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为t4多聚核苷酸激酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，含有初级探针的杂交缓冲液体系...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴金霞，殷圣杰，汪方奎，张斯姮，曹罡，李星池，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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