【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的制造中使用的蛋白质以及使用该蛋白质的4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的制造方法。另外，本专利技术涉及高效的反式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的制造方法。
技术介绍
1、4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸(4-(aminomethyl)cyclohexanecarboxylicacid；amcha)是作为纤溶酶抑制剂开发的人工合成氨基酸(非专利文献1)。amcha中存在顺式型和反式型的立体异构体。其中，非专利文献2确认了反式型具有纤溶酶抑制作用。作为反式型的4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的反式-4-氨甲基环己烷-1-甲酸(t-amcha)也被称为氨甲环酸(tranexamic acid；txa)，由于其纤溶酶抑制作用，因而可作为止血剂、抗炎剂用于出血的预防和治疗(非专利文献3～4)。
2、作为4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的制造方法，已知主要有化学合成法。例如，专利文献1中公开了通过以4-(氯甲基)苯甲酸作为起始底物、经过氨基化反应和氢化反应而生成4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸、接着异构化反应这3步化学合成反应来制造反式体的4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的方法。
3、包括上述的化学合成法需要在高温和高压下反应，存在能源成本高、环境负荷也重的问题。
4、作为化学合成法的替代，可列举利用微生物的制造方法。专利文献2中公开了使属于棒杆菌属或诺卡菌属的微生物与1,4-双(氨甲基)-环己烷的顺式体和反式体的混合物接触来制造反式体的4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的
5、现有技术文献
6、专利文献
7、专利文献1：cn114014768a
8、专利文献2：日本特开昭63-152991号公报
9、非专利文献
10、非专利文献1：keio journal of medicine(1962)11,8,105-115
11、非专利文献2：keio journal of medicine(1964)18,4,177-185
12、非专利文献3：european journal of haematology(2020)104,2,79-87
13、非专利文献4：journal of trauma and acute care surgery(2019)86,1,101-107
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、本专利技术的目的在于，提供以1,4-双(氨甲基)环己烷作为底物基于酶反应制造4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的方法以及可用于该酶反应的微生物来源的蛋白质。
3、用于解决问题的方法
4、截至目前为止，还不了解由1,4-双(氨甲基)环己烷生成4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的反应途径。因此，本专利技术人设想了利用氨基转移酶和醛脱氢酶的两步酶反应途径，并分别筛选了可能具有目标活性的蛋白质。发现通过在大肠杆菌菌株中表达该蛋白质并进行纯化、实施酶反应，能够由1,4-双(氨甲基)环己烷生成4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸，从而完成了本专利技术。
5、本专利技术例如涉及以下的各专利技术。
6、[1]一种蛋白质，其具有使1,4-双(氨甲基)环己烷的氨基转移至其它化合物而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的氨基转移活性，并且由与序列号1～4和103～105中的任一者所示的氨基酸序列具有60％以上的一致性的氨基酸序列构成。
7、[2]一种dna，其编码[1]所述的蛋白质。
8、[3]一种重组体dna，其含有[2]所述的dna。
9、[4]一种重组细胞，其含有[2]所述的dna，或者通过用[3]所述的重组体dna转化宿主细胞而得到。
10、[5]一种蛋白质，其具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性，并且由与序列号19～22、35～46和127～139中的任一者所示的氨基酸序列具有50％以上的一致性的氨基酸序列构成。
11、[6]一种蛋白质，其具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性，并且由与序列号19～22、35～46和127～139中的任一者所示的氨基酸序列具有60％以上的一致性的氨基酸序列构成。
12、[7]一种dna，其编码[5]或[6]所述的蛋白质。
13、[8]一种重组体dna，其含有[7]所述的dna。
14、[9]一种重组细胞，其含有[7]所述的dna，或者通过用[8]所述的重组体dna转化宿主细胞而得到。
15、[10]一种用于由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造顺式体和/或反式体的4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的制造方法，其包括：
16、(i)在氨基转移酶存在下由1,4-双(氨甲基)环己烷制造4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的步骤；以及
17、(ii)在醛脱氢酶存在下由4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛制造4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的步骤。
18、[11]根据[10]所述的制造方法，其中，上述氨基转移酶为[1]所述的蛋白质，上述醛脱氢酶为[5]或[6]所述的蛋白质。
19、[12]根据[10]或[11]所述的制造方法，其中，包括在上述方法的一部分或全部中使丙氨酸脱氢酶和/或nadh氧化酶共存的步骤。
20、[13]根据[10]～[12]中任一项所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造反式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
21、[14]根据[10]～[12]中任一项所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造顺式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
22、[15]根据[10]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，上述方法的一部分或全部在中性或碱性条件下进行。
23、[16]根据[15]所述的制造方法，其中，上述方法的一部分或全部在仲胺存在下进行。
24、[17]一种蛋白质，其为醛脱氢酶，具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性。
25、[18]根据[17]所述的蛋白质，其为苯甲醛脱氢酶，具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性。
26、[19]根据[17]或[18]所述的蛋白质，其中，上述醛脱氢酶为假单胞菌属细菌来源的醛脱氢酶。
27、[20]根据[17]或[18]所述的蛋白质，其由与序列号19～22、35～46和127～139中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蛋白质，其具有使1,4-双(氨甲基)环己烷的氨基转移至其它化合物而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的氨基转移活性，并且由与序列号1～4和103～105中的任一者所示的氨基酸序列具有60%以上的一致性的氨基酸序列构成。
2.一种DNA，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.一种重组体DNA，其含有权利要求2所述的DNA。
4.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的DNA，或者通过用权利要求3所述的重组体DNA转化宿主细胞而得到。
5.一种蛋白质，其具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性，并且由与序列号19～22、35～46和127～139中的任一者所示的氨基酸序列具有50%以上的一致性的氨基酸序列构成。
6.一种蛋白质，其具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性，并且由与序列号19～22和35～46中的任一者所示的氨基酸序列具有60%以上的一致性的氨基酸序列构成。
7.一种DNA，其编码权利要
8.一种重组体DNA，其含有权利要求7所述的DNA。
9.一种重组细胞，其含有权利要求7所述的DNA，或者通过用权利要求8所述的重组体DNA转化宿主细胞而得到。
10.一种用于由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造顺式体和/或反式体的4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的制造方法，其包括：
11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述氨基转移酶为权利要求1所述的蛋白质，所述醛脱氢酶为权利要求6所述的蛋白质。
12.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，在所述方法的一部分或全部中使丙氨酸脱氢酶和/或NADH氧化酶共存。
13.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造反式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
14.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造顺式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
15.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，所述方法的一部分或全部在中性或碱性条件下进行。
16.根据权利要求15所述的制造方法，其中，所述方法的一部分或全部在仲胺存在下进行。
17.一种蛋白质，其为醛脱氢酶，具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性。
18.根据权利要求17所述的蛋白质，其为苯甲醛脱氢酶，具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性。
19.根据权利要求17所述的蛋白质，其中，所述醛脱氢酶为假单胞菌(Pseudomonas)属细菌来源的醛脱氢酶。
20.根据权利要求17所述的蛋白质，其由与序列号19～22、35～46和127～139中的任一者所示的氨基酸序列具有50%以上的一致性的氨基酸序列构成。
21.一种蛋白质，其具有由4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性，由与序列号20所示的氨基酸序列具有50%以上的一致性且在与序列号20所示的氨基酸序列比对时含有下述[1]～[26]中的至少一个氨基酸基的氨基酸序列构成，
22.一种DNA，其编码权利要求5和17～21中任一项所述的蛋白质。
23.一种重组体DNA，其含有权利要求22所述的DNA。
24.一种重组细胞，其含有权利要求22所述的DNA。
25.一种重组细胞，其通过用权利要求23所述的重组体DNA转化宿主细胞而得到。
26.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述氨基转移酶为权利要求1所述的蛋白质，所述醛脱氢酶为权利要求5和17～21中任一项所述的蛋白质。
27.根据权利要求26所述的制造方法，其中，在所述方法的一部分或全部中使丙氨酸脱氢酶和/或NADH氧化酶共存。
28.根据权利要求26所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造反式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
29.根据权利要求26所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造顺式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
30.根据权利要求26所述的制造方法，其中，所述方法的一部分或全部在中性或碱性条件下进行。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种蛋白质，其具有使1,4-双(氨甲基)环己烷的氨基转移至其它化合物而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的氨基转移活性，并且由与序列号1～4和103～105中的任一者所示的氨基酸序列具有60%以上的一致性的氨基酸序列构成。
2.一种dna，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.一种重组体dna，其含有权利要求2所述的dna。
4.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的dna，或者通过用权利要求3所述的重组体dna转化宿主细胞而得到。
5.一种蛋白质，其具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性，并且由与序列号19～22、35～46和127～139中的任一者所示的氨基酸序列具有50%以上的一致性的氨基酸序列构成。
6.一种蛋白质，其具有使4-(氨甲基)环己烷-1-甲醛的醛基氧化而产生4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的醛脱氢酶活性，并且由与序列号19～22和35～46中的任一者所示的氨基酸序列具有60%以上的一致性的氨基酸序列构成。
7.一种dna，其编码权利要求6所述的蛋白质。
8.一种重组体dna，其含有权利要求7所述的dna。
9.一种重组细胞，其含有权利要求7所述的dna，或者通过用权利要求8所述的重组体dna转化宿主细胞而得到。
10.一种用于由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造顺式体和/或反式体的4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸的制造方法，其包括：
11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述氨基转移酶为权利要求1所述的蛋白质，所述醛脱氢酶为权利要求6所述的蛋白质。
12.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，在所述方法的一部分或全部中使丙氨酸脱氢酶和/或nadh氧化酶共存。
13.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造反式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
14.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，由顺式体和/或反式体的1,4-双(氨甲基)环己烷制造顺式-4-(氨甲基)环己烷-1-甲酸。
15.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，所述方法的一部分或全部在中性或碱性条件下进行。
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【专利技术属性】
技术研发人员：合田明日香，山下诚，绞缬健人，青木山本祐梨子，渡边太郎，
申请(专利权)人：麒麟控股株式会社，
类型：发明
国别省市：
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