【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脂质提取，特别涉及一种植物糖鞘脂的提取方法。
技术介绍
1、植物质膜(plasmamembrane，pm)是细胞与外部环境之间的重要屏障，控制信号感知和传输。它由不对称的脂质双层组成，由三种不同的脂质类别组成：鞘脂，甾醇和磷脂。糖基肌醇磷酸神经酰胺(glycosyl inositol phosphoryl ceramide，gipcs)约占总脂质的1/4，是含量最高的鞘脂，显示出很大的结构多样性，在植物细胞的生物反应中发挥重要的信号传导作用。随着gipcs近年来越来越多的被分子生物学家关注，gipcs的小量、简易提取方法被提上日程。gipcs糖基头部，与普通脂质不同，具有更强的两亲性，提取过程更为复杂。在过去，gipcs的提取需要几十克植物材料，并且需要一些化学实验室配备的萃取设备和加热装置，不仅操作步骤繁琐，也易导致gipcs的提取纯度降低。
技术实现思路
1、鉴于此，为了更方便生物学研究者的小量提取和鉴定，本专利技术的目的在于提出一种植物糖鞘脂的提取方法，本专利技术可以从1～3g植物材料中提取出可供后续鉴定的gipcs，在本专利技术提供的提取方法中，还利用液氮研磨、振荡萃取、高速离心和真空干燥代替了传统的搅拌、重力萃取、真空过滤和氮气干燥，提取效率更高并方便分子生物学实验室操作和节约时间；并且，在此提取方法中首次在使用60％～70％乙醇初次萃取gipcs时加入β-巯基乙醇以防止脂质氧化，提高gipcs的提取效率；首次在乙醇萃取结束后，高温离心，去除细胞碎片和不溶物
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、一种植物糖鞘脂的提取方法，包括如下步骤：
4、s1：取植物材料，液氮研磨后，放入50ml离心管，加入浓度60％～70％的热乙醇溶液进行振荡萃取，8000～14000rpm高速高温离心，取上清，-20℃或-40℃低温冰箱放置超过1小时后高速低温离心获得得粗提物；所述植物材料和乙醇溶液的质量体积比为1～3g：10～30ml；如有需要可等比放大提取。
5、s2：采用有机溶剂将粗提物进行吹打洗涤，高速低温离心后弃去有机溶剂，保留沉淀，而后通风橱静置挥发残留有机溶剂，加入溶解液，高温振荡溶解沉淀后立即过滤，取滤液进行真空离心干燥，得粗产物；所述有机溶剂包括丙酮和乙醚；所述溶解液包括四氢呋喃、甲醇和水；
6、s3：在粗产物中加入正丁醇和水，高温溶解沉淀，高速高温离心后，取上层正丁醇相，进行真空离心干燥，得目标产物。
7、本专利技术提供的植物糖鞘脂的提取方法，在仪器设备的使用上，舍弃了过往gipcs提取方法中的搅拌、抽滤、回流萃取等设备，因为这些设备不适用于提取小量样本，且分子生物学实验室往往并不配备，而是采用了分子生物学实验室常备的高速离心机、烘箱、摇床、涡旋振荡仪和小型真空离心机。在提取步骤上，本专利技术利用液氮研磨代替了破碎机打碎植物组织，研磨更充分、提取效率更高(图1a)；省略了以往加入0.1％乙酸打碎植物组织再低温真空抽滤获取沉淀的步骤，研磨后的植物材料粉末装入离心管，直接加入60％～70％热乙醇(添加0.8～1.2％β-巯基乙醇防氧化)，节约时间更为简便(图1b)；密闭的离心管中60％～70％乙醇高温振荡萃取植物材料中的gipcs并结合高温离心获得萃取液代替在高温环境里利用重力多次萃取沉淀，不仅防止乙醇蒸发、节约时间，且萃取更充分、也避免了不溶杂质透过滤布进入滤液(图1b,c)；利用裂解液高温振荡溶解gipcs粗提物沉淀代替超声加热溶解沉淀，溶解更充分，进一步提高提取效率(图1h)；利用真空离心机代替过往的氮气吹干器来获得沉淀，节约时间、操作更简便且沉淀不容易损失(图1i-k)，使用本专利技术的提取方法，从数克样本即可提取到质谱鉴定gipcs和离子色谱鉴定gipcs糖基构成所需要的样品量。此外，使用500ml的大离心瓶，该方法也适合30～40g大量植物组织的gipcs提取，提取方法灵活，适用范围广。
8、进一步的方案是，步骤s1中，所述植物材料包括叶片、茎或根中的至少一种，所述植物材料包括草本植物、禾本植物或茄科植物。
9、进一步的方案是，步骤s1中，所述体积浓度60～70％乙醇溶液中还添加0.8％v/v～1.2％v/v的β-巯基乙醇；所述振荡萃取的条件为：100～2000rpm，50～70℃，20min～3h。
10、进一步的方案是，步骤s1和s3中，所述高速高温离心是指进行50～70℃离心4～10min；步骤s1和s2中，高速低温离心是指2～6℃，8000～14000rpm，离心8～20min。
11、进一步的方案是，步骤s2中，所述丙酮或乙醚在使用前进行-20或-40℃的预冷操作，所述离心的方式为：8000～14000rpm，2～6℃，8～20min；所述重复吹打洗涤1～2次。
12、进一步的方案是，步骤s2中，所述溶解液包括质量比为3～4：3～4：1的四氢呋喃、甲醇和水，所述溶解液中还包括加入0.1％v/v的甲酸，每50ml离心管加入4～12ml所述溶解液；所述溶解为振荡溶解，条件为：100～300rpm，50～70℃，1～3h。所述过滤为，高温溶解完成后，溶液立即通过0.22μm或0.45μm的有机相滤器，获得滤液1ml/管分装至2ml离心管方便后续真空离心干燥。
13、进一步的方案是，步骤s3中，每个2ml离心管加入600～800μl正丁醇和600～800μl水；50～70℃溶解沉淀后，以50～70℃，10000～14000rpm的条件离心4～10min，吸取上层清液进行真空离心干燥。
14、进一步的方案是，步骤s2和s3中所述真空离心干燥是指，装有gipcs溶液的2ml离心管敞口放置于真空离心机中，保持0.05～0.1mpa真空度，低转速离心2～6h，获得gipcs沉淀。
15、本专利技术提供上述的一种植物糖鞘脂的提取方法提取得到的糖鞘脂，具体为糖基肌醇磷酸神经酰胺。
16、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
17、本专利技术采用液氮充分研磨结合添加β-巯基乙醇的乙醇溶液进行高温振荡提取，提高gipcs的得率，高温离心和高温微孔滤膜过滤除去提取物中的杂质，提高gipcs的纯度。本专利技术提供的提取方法，不仅操作简单，提取效率高，且可有效实现小份量植物材料即可提取得到质谱鉴定gipcs和离子色谱鉴定gipcs糖基构成所需的样本量。
18、本专利技术针对小量植物样本开发出一种简单、易操作、高效的gipcs提取方法，提取工艺稳定，采用本专利技术提供的提取方法，一次提取即可得到质谱、色谱等鉴定gipcs所需的样本量，提取效率高，提取所需时间少。
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1.一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤S1中，所述植物材料包括叶片、茎或根中的至少一种，所述植物原料包括草本植物、禾本植物或茄科植物。
3.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤S1中，所述乙醇溶液浓度为60％v/v～70％v/v，添加0.8％v/v～1.2％v/v的β-巯基乙醇，并在使用前预热至50～70℃；所述振荡萃取的条件为：100～2000rpm，50～70℃，20min～3h。
4.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤S1和S3中，所述高速高温离心是指50～70℃、8000～14000rpm离心4～10min。
5.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤S1和S2中，所述低温放置是指-20或-40℃冰箱放置至少1h，所述高速低温离心是指2～6℃、8000～14000rpm离心8～20min。
6.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述高温溶解为高温振荡溶解，每50mL离心管加入4～12mL溶解液，溶解条件为：100～300rpm，50～70℃，1～3h；所述过滤为，高温溶解完成后，溶液立即通过0.22μm或0.45μm的有机相滤器，获得滤液1mL/管分装至2mL离心管。
8.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤S3中，每2mL离心管加入600～800μL正丁醇和600～800μL水；50～70℃溶解沉淀后，以50～70℃，10000～14000rpm的条件离心4～10min获取上层丁醇相。
9.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤S2和S3中，真空离心干燥是指，装有GIPCs溶液的2mL离心管敞口放置于真空离心机中，保持0.05～0.1MPa真空度，低转速离心2～6h，获得GIPCs沉淀。
10.权利要求1～9任一项所述的一种植物糖鞘脂的提取方法提取得到的糖鞘脂。
...【技术特征摘要】
1.一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤s1中，所述植物材料包括叶片、茎或根中的至少一种，所述植物原料包括草本植物、禾本植物或茄科植物。
3.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤s1中，所述乙醇溶液浓度为60％v/v～70％v/v，添加0.8％v/v～1.2％v/v的β-巯基乙醇，并在使用前预热至50～70℃；所述振荡萃取的条件为：100～2000rpm，50～70℃，20min～3h。
4.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤s1和s3中，所述高速高温离心是指50～70℃、8000～14000rpm离心4～10min。
5.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤s1和s2中，所述低温放置是指-20或-40℃冰箱放置至少1h，所述高速低温离心是指2～6℃、8000～14000rpm离心8～20min。
6.根据权利要求1所述的一种植物糖鞘脂的提取方法，其特征在于，步骤s2中，所述丙酮或乙醚在使用前进行-20或-40℃的预冷操作，所述离心的方式为：10000～140...
【专利技术属性】
技术研发人员：仝征，王丹，彭存智，徐兵强，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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