【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体及其构建方案和应用。
技术介绍
1、逆转录酶ucrt v6，来源于黄石公园耐热菌分离的病毒(通过耐热细菌病毒宏基因组测序，筛选出功能性基因pol(a))。具有多种酶活、耐高温的特性，最佳酶活温度60-70℃。用于rna逆转录为cdna，相较于传统的逆转录酶(mmlv)，具有较高的耐热性，在60-80℃区间具有较高的逆转录酶活性，因此，ucrt v6逆转录酶可特异性应用于复杂模板(gc含量高/rna二级结构较多)，提高此类rna模板的逆转录效率，基于热稳定性对酶应用性能的重要影响，获得高热稳定性的酶一直是酶工程领域的研究热点。
2、蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质以满足人类对生产和生活的需求。理性设计是蛋白质工程改造中最常用的方法，利用计算机辅助分子模型结合定点突变，以实现蛋白质功能优化，如提高催化活性、热稳定性、耐酸碱性等。为了有效优化蛋白质的热稳定性，markus wyss等人于2001年提出consensus concept理论。和常规蛋白质理性设计方法基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，consensus concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。本专利技术以consensus concept理论为指导思想，对逆转录酶ucrt v6家族序列进行整合分析，并结合生物信
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提高现有的逆转录酶ucrt v6热稳定性。
2、为此，本专利技术提供了一种热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体，所述逆转录酶ucrt v6突变体为如下(a1)或(a2)：
3、(a1)将seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与seq id no.2所示的氨基酸序列具有相同功能的衍生蛋白；
4、(a2)将seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的衍生蛋白。
5、具体的，上述逆转录酶ucrt v6突变体的氨基酸序列被配置为seq id no.2上的突变位点y386h、w521y、v190t、s254a中的一种或多种组合发生突变后的氨基酸序列。
6、具体的，上述突变位点为y386h、w521y、v190t、s254a、y386h/w521y、y386h/v190t、y386h/s254a、w521y/v190t、w521y/s254a、v190t/s254a、y386h/w521y/v190t、y386h/w521y/s254a、w521y/v190t/s254a、y386h/v190t/s254a或y386h/w521y/v190t/s254a。
7、具体的，上述y386h对应的单点突变体的氨基酸序列为seq id no.3；
8、w521y对应的单点突变体的氨基酸序列为seq id no.4；
9、v190t对应的单点突变体的氨基酸序列为seq id no.5；
10、s254a对应的单点突变体的氨基酸序列为seq id no.6；
11、y386h/w521y对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.7；
12、y386h/v190t对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.8；
13、y386h/s254a对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.9；
14、w521y/v190t对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.10；
15、w521y/s254a对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.11；
16、v190t/s254a对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.12；
17、y386h/w521y/v190t对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.13；
18、y386h/w521y/s254a对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.14；
19、w521y/v190t/s254a对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.15；
20、y386h/v190t/s254a对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.16；
21、y386h/w521y/v190t/s254a对应的组合突变体的氨基酸序列为seq id no.17。
22、本专利技术还提供了上述热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体的构建方法，包括以下步骤：
23、在数据库中搜索、选取与seq id no.2所示的氨基酸序列一致性大于50％的氨基酸序列，然后进行多序列比对，通过软件生成可以后期编辑的consensus sequence；
24、对seq id no.2进行蛋白质三维结构预测，筛选出稳定性相关的突变位点：y386h、w521y、v190t、s254a。
25、具体的，上述突变位点y386h的扩增引物序列为seq id no.20、seq id no.21；
26、突变位点w521y的扩增引物序列为seq id no.22、seq id no.23；
27、突变位点v190t的扩增引物序列为seq id no.24、seq id no.25；
28、突变位点s254a的扩增引物序列为seq id no.26、seq id no.27。
29、本专利技术还提供了上述热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体的基因。
30、本专利技术还提供了包含上述基因的重组质粒。
31、本专利技术还提供了包含上述热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。
32、本专利技术提供的热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体可用于将rna逆转录为cdna。
33、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
34、1、本专利技术提供的这种热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体包括单点突变体和组合突变体，与野生型逆转录酶ucrt v6相比，其单点突变体和组合突变体在65℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，其半衰期大约是野生型的5倍。ucrt v6突变体具有优良的催化活性，具有较好的应用前景。
35、2、本专利技术提供的热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体的构建方法，与理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，本专利技术以consensus concept理论为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体，其特征在于，所述逆转录酶UCRT v6突变体为如下(a1)或(a2)：
2.如权利要求1所述的热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体，其特征在于：所述逆转录酶UCRT v6突变体的氨基酸序列被配置为SEQ ID NO.2上的突变位点Y386H、W521Y、V190T、S254A中的一种或多种组合发生突变后的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体，其特征在于：所述突变位点为Y386H、W521Y、V190T、S254A、Y386H/W521Y、Y386H/V190T、Y386H/S254A、W521Y/V190T、W521Y/S254A、V190T/S254A、Y386H/W521Y/V190T、Y386H/W521Y/S254A、W521Y/V190T/S254A、Y386H/V190T/S254A或Y386H/W521Y/V190T/S254A。
4.如权利要求2所述的热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体，其特征在于：
5.如权利
6.如权利要求5所述的热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体的构建方法，其特征在于：
7.一种编码如权利要求1-4任一所述的热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体的基因。
8.一种包含如权利要求7所述基因的重组质粒。
9.一种包含如权利要求1-4任一所述的热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。
10.如权利要求1-4任意一项所述的热稳定性提高的逆转录酶UCRT v6突变体在将RNA逆转录为cDNA的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体，其特征在于，所述逆转录酶ucrt v6突变体为如下(a1)或(a2)：
2.如权利要求1所述的热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体，其特征在于：所述逆转录酶ucrt v6突变体的氨基酸序列被配置为seq id no.2上的突变位点y386h、w521y、v190t、s254a中的一种或多种组合发生突变后的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的热稳定性提高的逆转录酶ucrt v6突变体，其特征在于：所述突变位点为y386h、w521y、v190t、s254a、y386h/w521y、y386h/v190t、y386h/s254a、w521y/v190t、w521y/s254a、v190t/s254a、y386h/w521y/v190t、y386h/w521y/s254a、w521y/v190t/s254a、y386h...
【专利技术属性】
技术研发人员：马富强，陈骁，陆泽林，江晶洁，桂萍，王学峰，罗成坤，唐玉国，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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