【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般地涉及免疫学和肿瘤学领域，更具体地涉及治疗、预防或抑制增殖性疾病，特别是癌症、感染性疾病和与tnf细胞因子功能障碍相关的病症的组合物和方法。实施方案包括含有tnf-超家族(tnfsf)配体或其受体结合结构域的spd-tnfsf融合蛋白，其融合至表面活性蛋白-d(spd)的卷曲螺旋结构域，含有多个spd-tnfsf融合蛋白的三聚体或多聚体融合蛋白。实施方案还包括表达载体，例如mrna、质粒和病毒，所述表达载体包含编码一种或多种spd-tnfsf融合蛋白的核苷酸序列。spd-tnfsf融合蛋白、编码spd-tnfsf融合蛋白的分离的核苷酸序列、mrna、质粒和病毒适合于药物组合物，并且适合于用于治疗癌症和感染性疾病，并且更一般地用于治疗与tnf细胞因子的功能障碍相关的增殖性疾病和病症的用途。
技术介绍
1、癌症由外部因素(例如烟草、传染性生物体、饮食习惯、化学品和辐射)和内部因素(例如遗传突变、激素、免疫病况和由代谢发生的突变)引起。每年全球有超过1200万个体被诊断出患有癌症。在工业化国家，每五人中大约有一人死于癌症。尽管存在大量的化疗药物，但它们通常是无效的，并且仍然存在对有效且毒性较小的疗法的未满足的医学需要，尤其是对于对现有治疗有抗性的患者。
2、有效的t细胞应答需要功能性的和最佳的先天和适应性免疫，这特别取决于不同细胞之间通过可溶性刺激和表面接头/受体结合的多种特异性相互作用。在此背景下，cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答在抗肿瘤免疫中起关键作用(ara等人,2018,immunotarge
3、肿瘤坏死因子(tnf)超家族作为共刺激分子在免疫调节和抗肿瘤免疫中发挥关键作用(vinay等人,2009,cell biol int.；33(4):453-465)。tnfsf成员通过t细胞的塑造特性介导免疫应答是众所周知的。先前的研究允许鉴定下列tnfsf成员：cd40l、4-1-bbl、ox40l、cd70、tnf、gitrl、light、fasl、tweak、april、rankl、trail、cd30l、ngf、baff、ltβ、ltα、ltαβ2、tl1a、tla、eda。
4、抗原特异性t细胞的有效抗原识别关键取决于特化的抗原呈递细胞(apc)如b细胞和树突细胞(dc)的存在和功能。例如，尽管cd40在许多细胞类型上表达(包括巨噬细胞、b细胞和dc)，但其配体cd40l主要在活化的cd4+t细胞上表达。cd40l在活化的b、t和nk细胞表面表达，但也在脂肪细胞和嗜碱性粒细胞上表达(richards等人hum vaccinimmunother.2020；16(2):377-387)。在cd4+t细胞上表达的cd40l和在dc上表达的cd40之间的直接相互作用，通过上调共刺激分子，“许可”dc引发cd8 t细胞应答。这种cd40l-cd40相互作用导致携带cd40的细胞的活化，然后表达粘附(icam)，共刺激(cd80/cd86)，并呈递除细胞因子/趋化因子(tnfα，il6…)之外的mhc i和ii分子。在肿瘤微环境中，粘附分子和细胞因子/趋化因子一起作用以诱导免疫细胞的浸润和活化，其最终破坏肿瘤细胞并将肿瘤从免疫抑制微环境转变为免疫活性微环境(richards等人hum vaccin immunother.2020；16(2):377-387)。类似地，tnfsf受体4-1-bb、ox40、gitr和cd27在t细胞上表达，并通过apc、淋巴细胞和先天免疫细胞上表达的配体对共刺激作出应答。这些不同的研究已经突出了开发tnfsf配体以治疗增殖性疾病如癌症和与tnf细胞因子功能障碍相关的病症如感染性疾病的兴趣。
5、近年来，tnf超家族配体已经成为开发疫苗和免疫疗法的有吸引力的候选者，更具体地如设计新分子佐剂的替代方法(gupta等人,2013,immunol res.,57(1-3):303-10)。佐剂可改变先天和适应性免疫应答的强度、质量和功能，集中于快速诱导大量能够保护免受特定疾病的cd8 t细胞(lauterbach等人,2013,front immunol.,27；4:251)。重组mva-cd40l已经证明了cd40l佐剂病毒诱导快速强抗原特异性cd8t细胞应答的潜力，用于开发针对癌症和感染性疾病如hiv/aids、埃博拉和马尔堡出血热、疟疾和丙型肝炎的预防性和治疗性疫苗(lauterbach等人,2013,front immunol.2013aug 27；4:251)。还开发了一种用cd40l武装腺病毒的方法，以刺激有益的免疫应答来治疗肿瘤(pesonen等人,2012,cancerres.,72(7))。以相同的方式，通过提供强有力的t-细胞应答，重组4-1-bbl腺病毒是用于人记忆cd8 t细胞的有希望的佐剂，并提示在抗病毒治疗策略中是有益的(bukczynski etal.,2004,proc natl acad sci u s a.；101(5):1291-1296)。
6、本领域技术人员还认识到tnfsf配体通常需要同多聚化以完全激活应答细胞。tnfsf信号转导，其也是结构上明确定义的，需要适当的受体聚簇和至少三聚体化。虽然tnfsf配体通过自组装以三聚体单位存在，但受体在细胞表面上通常是分开的(richards等人2020,hum vaccin immunother.,16(2):377-387)。多聚体tnfsf配体与其相应受体之间的相互作用导致精确的受体聚簇，并且是产生信号传递至细胞的先决条件(kucka等人,2020,front cell dev biol.,8:615141)。如前所示，高阶的寡聚tnfsf配体，特别是十二聚体tnfsf配体在信号转导方面比单一三聚体tnfsf配体更有效(haswell等人2001,eurjimmunol.,31(10):3094-100)。
7、由于tnfsf配体在免疫应答，更具体地在肿瘤应答中的关键作用，已经研究了多种策略来增强它们的激动剂特性，如与作为胶原凝集素家族成员的表面活性蛋白d的融合。
8、专利申请wo01/49866公开了第一种重组融合蛋白，其包含tnf细胞因子和二聚或多聚化结构域以增加配体的亲合力。然而，由于多聚化结构域的分子量，tnf蛋白的多聚化相当低效。wo01/42298公开了构建稳定的生物活性融合蛋白的方法以表达tnfsf(更特别地是cd40l和rankle/trance成员)，与胶原凝集素(更特别地是包含信号序列、胶原蛋白结构域和卷曲螺旋颈结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种SPD-TNFSF融合蛋白，包含：
2.根据权利要求1的SPD-TNFSF融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含在SPD的N端结构域和卷曲螺旋颈结构域之间的胶原蛋白结构域。
3.根据权利要求2的SPD-TNFSF融合蛋白，其中所述胶原蛋白结构域包含1至40个(GXX)重复、优选3至30个(GXX)重复、优选6至20个(GXX)重复、更优选12个(GXX)重复，其中X为氨基酸，且G为甘氨酸氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项的SPD-TNFSF融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含在卷曲螺旋颈结构域和TNF-超家族配体或其受体结合域之间的接头。
5.根据权利要求4的SPD-TNFSF融合蛋白，其中所述接头是甘氨酸/丝氨酸接头，并且具有4-20个氨基酸的长度，优选8-16个氨基酸的长度，更优选12个氨基酸的长度。
6.根据权利要求1至5中任一项的SPD-TNFSF融合蛋白，其中所述TNF-超家族配体选自CD40L、4-1-BBL、CD70、OX40L、TNF、GITRL、LIGHT、FASL、TWEAK、APRIL、
7.根据权利要求1至6中任一项的SPD-TNFSF融合蛋白，其中N端结构域与SEQ ID NO:1中的氨基酸序列具有至少85％、优选至少90％、和更优选至少95％的同一性。
8.根据权利要求1至7中任一项的SPD-TNFSF融合蛋白，包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11。
9.一种三聚体融合蛋白，其包含三个根据权利要求1至8的融合蛋白。
10.一种多聚体融合蛋白，其包含根据权利要求9的多个三聚体融合蛋白，其形成六聚体、十二聚体、十八聚体或高阶寡聚体，优选六聚体，更优选十二聚体。
11.一种分离的核苷酸序列，其编码权利要求1-8中任一项所定义的融合蛋白。
12.根据权利要求11的分离的核苷酸序列，其中所述序列包含或由以下组成：SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21。
13.一种mRNA，其包含如权利要求11所定义的核苷酸序列。
14.一种质粒，其包含如权利要求11或12所定义的核苷酸序列。
15.一种病毒，其包含权利要求11或12所定义的核苷酸序列。
16.根据权利要求15的病毒，其中所述病毒是溶瘤病毒或非溶瘤病毒。
17.根据权利要求16的病毒，其中所述溶瘤病毒选自痘病毒、疱疹病毒、呼肠孤病毒、塞内卡病毒(SVV)、水泡性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒属、泡沫病毒、α病毒、慢病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、弹状病毒、微小核糖核酸病毒科、柯萨奇病毒、细小病毒或其嵌合体。
18.根据权利要求17的病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒，并且属于正痘病毒属，优选选自痘苗病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒和鼠痘病毒。
19.根据权利要求18的病毒，其中所述溶瘤痘病毒是痘苗病毒，并且特别是选自Elstree、Wyeth、Copenhagen、Lister、Tian Tian和Western Reserve株的痘苗病毒。
20.权利要求17的病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒，并且属于兔痘病毒属，优选选自粘液瘤病毒、兔纤维瘤病毒和松鼠纤维瘤病毒，优选粘液瘤病毒。
21.根据权利要求18至20中任一项的病毒，其中所述溶瘤痘病毒是胸苷激酶(TK)活性缺陷的病毒，所述胸苷激酶(TK)活性缺陷是由J2R病毒基因中的失活突变导致的。
22.根据权利要求21的病毒，其中所述溶瘤痘病毒是核糖核苷酸还原酶(RR)活性缺陷的病毒，所述核糖核苷酸还原酶(RR)活性缺陷是由病毒I4L和/或F4L基因中的失活突变导致的。
23.根据权利要求21或22中任一项的病毒，其中所述溶瘤痘病毒是m2功能缺陷的病毒，所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种spd-tnfsf融合蛋白，包含：
2.根据权利要求1的spd-tnfsf融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含在spd的n端结构域和卷曲螺旋颈结构域之间的胶原蛋白结构域。
3.根据权利要求2的spd-tnfsf融合蛋白，其中所述胶原蛋白结构域包含1至40个(gxx)重复、优选3至30个(gxx)重复、优选6至20个(gxx)重复、更优选12个(gxx)重复，其中x为氨基酸，且g为甘氨酸氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项的spd-tnfsf融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含在卷曲螺旋颈结构域和tnf-超家族配体或其受体结合域之间的接头。
5.根据权利要求4的spd-tnfsf融合蛋白，其中所述接头是甘氨酸/丝氨酸接头，并且具有4-20个氨基酸的长度，优选8-16个氨基酸的长度，更优选12个氨基酸的长度。
6.根据权利要求1至5中任一项的spd-tnfsf融合蛋白，其中所述tnf-超家族配体选自cd40l、4-1-bbl、cd70、ox40l、tnf、gitrl、light、fasl、tweak、april、rankl、trail、cd30l、ngf、baff、ltβ、ltα、ltαβ2、tl1a、tla、eda更优选cd40l或4-1-bbl。
7.根据权利要求1至6中任一项的spd-tnfsf融合蛋白，其中n端结构域与seq id no:1中的氨基酸序列具有至少85％、优选至少90％、和更优选至少95％的同一性。
8.根据权利要求1至7中任一项的spd-tnfsf融合蛋白，包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11。
9.一种三聚体融合蛋白，其包含三个根据权利要求1至8的融合蛋白。
10.一种多聚体融合蛋白，其包含根据权利要求9的多个三聚体融合蛋白，其形成六聚体、十二聚体、十八聚体或高阶寡聚体，优选六聚体，更优选十二聚体。
11.一种分离的核苷酸序列，其编码权利要求1-8中任一项所定义的融合蛋白。
12.根据权利要求11的分离的核苷酸序列，其中所述序列包含或由以下组成：seq idno:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq idno:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21。
13.一种mrna，其包含如权利要求11所定义的核苷酸序列。
14.一种质粒，其包含如权利要求11或12所定义的核苷酸序列。
15.一种病毒，其包含权利要求11或12所定义的核苷酸序列。
16.根据权利要求15的病毒，其中所述病毒是溶瘤病毒或非溶瘤病毒。
17.根据权利要求16的病毒，其中所述溶瘤病毒选自痘病毒、疱疹病毒、呼肠孤病毒、塞内卡病毒(svv)、水泡性口炎病毒(vsv)、新城疫病毒(ndv)、麻疹病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)、麻疹病毒属、泡沫病毒、α病毒、慢病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、弹状病毒、微小核糖核酸病毒科、柯萨奇病毒、细小病毒或其嵌合体。
18.根据权利要求17的病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒，并且属于正痘病毒属，优选选自痘苗病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒和鼠痘病毒。
19.根据权利要求18的病毒，其中所述溶瘤痘病毒是痘苗病毒，并且特别是选自elstree、wyeth、copenhagen、lister、tian tian和western reserve株的痘苗病毒。
20.权利要求17的病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒，并且属于兔痘病毒属，优选选自粘液瘤病毒、兔纤维瘤病毒和松鼠纤维瘤病毒，优选粘液瘤病毒。
21.根据权利要求18至20中任一项的病毒，其中所述溶瘤痘病毒是胸苷激酶(tk)活性缺陷的病毒，所述胸苷激酶(tk)活性缺陷是由j2r病毒基因中的失...
【专利技术属性】
技术研发人员：JB·马钱德，
申请(专利权)人：特兰斯吉恩股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。