【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于禽蛋分析检测，尤其涉及一种基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法。
技术介绍
1、禽蛋中含有丰富的营养物质，包括蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等等，可提供人体日常所需的营养成分。不同禽蛋的营养成分构成有一定的差异，从而呈现出不同的风味和口感。例如，鸡蛋中的鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等)比鹌鹑蛋低，所以鸡蛋吃起来不如鹌鹑蛋鲜。已有研究表明，鹌鹑蛋含有丰富的蛋白质、脑磷脂、卵磷脂、赖氨酸、胱氨酸等营养物质，素有“卵中佳品”之称。
2、然而，目前，对鹌鹑蛋和鸡蛋的内在成分的研究相对较少，当取同样量体积的蛋清和蛋黄混合物摆放在一起时，无法区分该混合物是鸡蛋成分还是鹌鹑蛋成分，且目前也尚无关于鹌鹑蛋营养价值评价的有效方法。
3、因此，通过探究鹌鹑蛋和鸡蛋之间的差异蛋白，寻找鹌鹑蛋内在成分指标，建立一种可以鉴别和评价鹌鹑蛋的分析方法，用于鹌鹑蛋的鉴别及营养价值评价，具有实际的重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术提供的一种基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，旨在解决上述
技术介绍
中存在的问题。
2、为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术公开了一种基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，包括如下步骤：
4、(1)分别提取鹌鹑蛋和鸡蛋蛋清和蛋黄中的总蛋白，并对所述总蛋白进行酶解，冻干，得到酶解产物；>
5、(2)利用酶解产物配置供试品溶液，并利用液相色谱-二级质谱联用技术对供试品溶液进行生物信息学分析，鉴定出鹌鹑蛋和鸡蛋蛋清和蛋黄中的相关差异蛋白；
6、(3)通过所述差异蛋白鉴别鹌鹑蛋和鸡蛋。
7、在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(1)中，提取总蛋白的方法包括如下步骤：
8、从-80℃冰箱取出鹌鹑蛋和鸡蛋组织样品，低温研磨成粉，迅速转移至液氮预冷的离心管，加入蛋白裂解液充分裂解，得到裂解液；
9、对所述裂解液进行离心，取上清，加入dtt反应，之后加入足量iam，继续反应，得到反应液；
10、向所述反应液中加入预冷后的丙酮，并于-20℃条件下沉淀，离心，收集沉淀；
11、向所述沉淀中加入预冷丙酮重悬清洗沉淀，离心，收集沉淀，风干；
12、向清洗后的所述沉淀中加入蛋白溶解液溶解蛋白沉淀。
13、进一步的，所述蛋白裂解液为pasp蛋白裂解液，所述pasp蛋白裂解液中含有100mm碳酸氢铵、8m尿素，ph＝8；所述蛋白溶解液中含有8m尿素、100mm teab，ph＝8.5；离心条件为：于4℃、12000g离心15min，所述dtt浓度为10mm，于56℃反应1h；加入iam后继续反应条件为：于室温避光反应1h；所述预冷丙酮为在-20℃条件下预冷后的丙酮，向反应液中加入预冷后的丙酮体积为所述反应液体积的4倍；向沉淀中加入的预冷丙酮为1ml。
14、在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(1)中，对所述总蛋白进行酶解的方法为：取蛋白样品，加入蛋白溶解液补足体积至100μl，加入胰酶和teab缓冲液，混匀后进行酶切，再加入胰酶和cacl2酶切过夜，加入甲酸调节ph小于3，混匀后于室温离心，取上清缓慢通过c18除盐柱，之后使用清洗液连续清洗，再加入洗脱液洗脱，收集滤液，冻干。
15、进一步的，所述蛋白溶解液中含有8m尿素、100mm teab，ph＝8.5；所述清洗液为含有0.1％甲酸和3％乙腈的水溶液；所述洗脱液为含有0.1％甲酸和70％乙腈的水溶液。
16、在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(2)中，供试品溶液的配置方法为：使用10μl流动相a液溶解冻干粉末，4℃下14000g离心20min，取上清200g，作为供试品溶液；
17、液相色谱条件为：
18、色谱柱：自制c18分析柱，15cm×100μm,1.9μm；
19、流动相：a:0.1％甲酸-水；b:0.1％甲酸-乙腈；
20、流速：300nl/min；
21、洗脱梯度：0min时，98％a，2％b；45min时，78％a，22％b；50min时，65％a，35％b；55min时，20％a，80％b；60min时，20％a，80％b；
22、质谱条件为：使用tims tof pro2质谱仪，captive spray离子源，设定离子喷雾电压为1.5kv，质谱全扫描范围为m/z 100-1700，1/k0范围0.85-1.3v·s/cm2，ramp time100ms，lock duty cycle to 100％，pasef settings:10ms/ms scans，总循环时间1.17sec，离子强度阈值2500，scheduling目标强度为20000；生成质谱检测原始数据。
23、在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(2)中，进行生物信息学分析采用如下方法：
24、对所采集的数据根据coturnixjaponica 2.1和bgalgal1.pat.whiteleghornlayer.grcg7w_wz蛋白数据库使用搜库软件maxquant(2.0.3.0)搜索全部的结果谱图；搜库参数设置如下：前体离子的质量容差为10ppm，碎片离子的质量容差为0.02da。固定化修饰为半胱氨酸的烷基化修饰，可变修饰为甲硫氨酸氧化修饰，n端为乙酰化修饰，允许最多2个漏切位点；
25、对搜索到的结果谱图使用interproscan软件进行go和ipr功能注释，利用cog和kegg对鉴定到的蛋白质进行功能蛋白家族及通路分析，针对dep进行火山图分析、聚类热图分析以及go、ipr和kegg的通路富集分析，并使用string db软件预测可能的蛋白质-蛋白质相互作用。
26、进一步的，鉴定出鹌鹑蛋和鸡蛋蛋清中的相关差异蛋白为：e1a激活基因阻遏子1蛋白、γ烯醇化酶、淀粉样βa4蛋白、几丁质酶、组织蛋白酶x；蛋黄中的相关差异蛋白为：过氧化氢酶、卵黄膜外层蛋白1、溶菌酶c、凝聚素、防御素11、过氧化氢酶。
27、第二方面，本专利技术公开了一种鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的差异蛋白，所述差异蛋白包括蛋清中的差异蛋白：e1a激活基因阻遏子1蛋白、γ烯醇化酶、淀粉样βa4蛋白、几丁质酶、组织蛋白酶x，蛋黄中的差异蛋白：过氧化氢酶、卵黄膜外层蛋白1、溶菌酶c、凝聚素、防御素11、过氧化氢酶。
28、第三方面，本专利技术公开了如第二方面所述的差异蛋白在鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋中的应用。
29、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
30、本专利技术基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋获得uplc-ms/ms数据，然后对原始质谱数据采用coturnixjaponica 2.1和bgalgal1.pat.whiteleghornlayer.grcg7w_wz数据库鉴本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：步骤(1)中，提取总蛋白的方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：所述蛋白裂解液为PASP蛋白裂解液，所述PASP蛋白裂解液中含有100mM碳酸氢铵、8M尿素，pH＝8；所述蛋白溶解液中含有8M尿素、100mM TEAB，pH＝8.5；离心条件为：于4℃、12000g离心15min，所述DTT浓度为10mM，于56℃反应1h；加入IAM后继续反应条件为：于室温避光反应1h；所述预冷丙酮为在-20℃条件下预冷后的丙酮，向反应液中加入预冷后的丙酮体积为所述反应液体积的4倍；向沉淀中加入的预冷丙酮为1mL。
4.根据权利要求1所述的基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：步骤(1)中，对所述总蛋白进行酶解的方法为：取蛋白样品，加入蛋白溶解液补足体积至100
5.根据权利要求4所述的基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：所述蛋白溶解液中含有8M尿素、100mM TEAB，pH＝8.5；所述清洗液为含有0.1％甲酸和3％乙腈的水溶液；所述洗脱液为含有0.1％甲酸和70％乙腈的水溶液。
6.根据权利要求1所述的基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：步骤(2)中，供试品溶液的配置方法为：使用10μL流动相A液溶解冻干粉末，4℃下14000g离心20min，取上清200g，作为供试品溶液；
7.根据权利要求1所述的基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行生物信息学分析采用如下方法：
8.根据权利要求7所述的基于Label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：鉴定出鹌鹑蛋和鸡蛋蛋清的相关差异蛋白为：E1A激活基因阻遏子1蛋白、γ烯醇化酶、淀粉样βA4蛋白、几丁质酶、组织蛋白酶X；蛋黄中的相关差异蛋白为：过氧化氢酶、卵黄膜外层蛋白1、溶菌酶C、凝聚素、防御素11、过氧化氢酶。
9.一种鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋蛋清和蛋黄中的差异蛋白，其特征在于，所述蛋清中的差异蛋白包括E1A激活基因阻遏子1蛋白、γ烯醇化酶、淀粉样βA4蛋白、几丁质酶、组织蛋白酶X；所述蛋黄中的相关差异蛋白为：过氧化氢酶、卵黄膜外层蛋白1、溶菌酶C、凝聚素、防御素11、过氧化氢酶。
10.如权利要求9所述的差异蛋白在鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：步骤(1)中，提取总蛋白的方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：所述蛋白裂解液为pasp蛋白裂解液，所述pasp蛋白裂解液中含有100mm碳酸氢铵、8m尿素，ph＝8；所述蛋白溶解液中含有8m尿素、100mm teab，ph＝8.5；离心条件为：于4℃、12000g离心15min，所述dtt浓度为10mm，于56℃反应1h；加入iam后继续反应条件为：于室温避光反应1h；所述预冷丙酮为在-20℃条件下预冷后的丙酮，向反应液中加入预冷后的丙酮体积为所述反应液体积的4倍；向沉淀中加入的预冷丙酮为1ml。
4.根据权利要求1所述的基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌鹑蛋与鸡蛋的方法，其特征在于：步骤(1)中，对所述总蛋白进行酶解的方法为：取蛋白样品，加入蛋白溶解液补足体积至100μl，加入胰酶和teab缓冲液，混匀后进行酶切，再加入胰酶和cacl2酶切过夜，加入甲酸调节ph小于3，混匀后于室温离心，取上清缓慢通过c18除盐柱，之后使用清洗液连续清洗，再加入洗脱液洗脱，收集滤液，冻干。
5.根据权利要求4所述的基于label-free定量蛋白质组鉴别鹌...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴艳，皮劲松，张昊，付明，郑楠，孙静，黄涛，卜柱，潘爱銮，申杰，常玲玲，梁振华，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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