【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体公开了用于快速鉴定及定量检测金山醋酸乳杆菌的引物对、试剂盒及方法。
技术介绍
1、金山醋酸乳杆菌( acetilactobacillus jinshanensis)，首先被发现于食醋中，后在白酒酒醅发酵后期被发现占据主导作用，为酱香型白酒的风味起着决定性的作用，属于酿造功能微生物。因此，对食品发酵过程中重要功能菌株醋酸乳酸菌的动态演替变化情况的快速监测技术的开发对阐明食品发酵背后的酿造机理具有极为重要的意义，有助于酿造生产过程的监测与优化。
2、目前，金山醋酸乳杆菌的鉴定和定量方法，主要采用生理生化反应、选择性培养基纯培养分离计数的方法，但这些方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，且存在平板培养计数与菌液浓度线性度差的问题。不依赖培养的实时荧光定量pcr技术也被用于对金山醋酸乳杆菌的快速定量检测，如以金山醋酸乳杆菌苯丙氨酰-trna合成酶α亚基中特异性序列为分子标记，利用荧光定量pcr的方法对其进行精确定量（zl202110440735.6）。与之相类似的，kim e等人开发了利用特异性基因（糖苷水解酶、假定蛋白、转运蛋白等）序列对益生菌中干酪乳杆菌群类的鉴定（food microbiology,2020,90:103485）。然而，这种特异性基因序列的筛选都是基于高质量基因组测序的基础上，而在传统发酵食品生产过程中有大量未测序微生物存在，因此该策略可能会导致所开发的检测方法特异性不好的潜在应用隐患。
3、16s rrna为核糖体的
技术实现思路
1、针对这些缺陷，本项专利技术提供了用于快速鉴定及定量检测金山醋酸乳杆菌的引物对、试剂盒及方法，根据金山醋酸乳杆菌16s rdna中的特异保守序列设计可特异性扩增金山醋酸乳杆菌的引物对，结合pcr技术以及crispr-cas12a技术，实现了样品中金山醋酸乳杆菌的快速鉴定和准确定量。
2、为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种用于鉴定及定量检测金山醋酸乳杆菌的引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1-5中任一所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
4、核苷酸序列seq id no.1：gctagagaagaacgtaccaagt；
5、核苷酸序列seq id no.2：gttgctagagaagaacgtacca；
6、核苷酸序列seq id no.3：gtaccaagtaggaaatggctt；
7、核苷酸序列seq id no.4：tggtagtgacggtatctggtt；
8、核苷酸序列seq id no.5：aagtaggaaatggcttggtagt；
9、核苷酸序列seq id no.6：cctcttctgtactcaagtcgct。
10、本专利技术提供的引物对为针对金山醋酸乳杆菌16s rdna中的特异保守序列基因设计的特异性引物，通过利用标准菌株和酒醅样品以pcr验证所提供引物对的特异性和准确性，发现其只特异性扩增金山醋酸乳杆菌，而对发酵过程中的其他优势乳酸菌不敏感。
11、优选地，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.2中所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
12、第二方面，本专利技术还提供特异性鉴定/定量检测金山醋酸乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项引物对。
13、所述试剂盒针对的目标基因（target dna）的核苷酸序列如seq id no.8所示。
14、优选地，所述试剂盒中还包括dna聚合酶及缓冲液。
15、优选地，所述试剂盒为基于crispr-cas12a的金山醋酸乳杆菌检测试剂盒，所述试剂盒中还包括crrna、荧光报告探针和cas12a蛋白；所述crrna的核酸序列如seq id no.9所示；所述荧光报告探针为双标记的单链dna序列，5’端被标记为荧光基团，3’端被标记为猝灭基团。
16、更优选地，荧光报告探针的序列为荧光报告基团-ttatt-荧光淬灭基团，所述荧光报告探针的荧光基团为fam、hex、tet、joe和vic中的一种，荧光淬灭基团为bhq1、bhq2和bhq中的一种。
17、第三方面，本专利技术还提供上述引物对或上述试剂盒在鉴定和/或定量检测金山醋酸乳杆菌中的应用。
18、优选地，所述应用为上述引物对或上述试剂盒在发酵食品或者食品发酵过程中鉴定和/或定量检测金山醋酸乳杆菌中的应用。
19、所述发酵食品为利用微生物的作用制取的食品，包括但不限于白酒、酱油、食醋、豆豉、黄酒、啤酒、葡萄酒等。
20、优选地，所述应用为上述引物对或上述试剂盒在鉴定区分金山醋酸乳杆菌与植物乳杆菌（ lactiplantibacillus plantarum）、魏斯氏菌（ weissella sp.）、乳酸片球菌（ pediococcus acidilactici）、嗜酸乳杆菌（ lactobacillus acidophilus）中的应用。
21、第四方面，本专利技术还提供一种特异性鉴定金山醋酸乳杆菌的方法，利用上述引物对或上述试剂盒，对待测样品中的核酸进行检测，通过凝胶电泳观察产物条带位置或测序结果对所述待测样本中金山醋酸乳杆菌进行鉴定。
22、所述待测样品含有菌体、基因组或宏基因组。
23、所述待测样品可为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，所述发酵食品包括但不限于，白酒、食醋、大曲和酒醅等。
24、优选地，可对待测样品中的微生物进行菌落pcr或以待测样品中的微生物基因组为模板进行pcr，对pcr产物进行凝胶电泳，如果电泳图谱上pcr产物在100-250 bp之间有条带，则说明待测样品中含有金山醋酸乳杆菌；或对100-250 bp之间的pcr产物进行测序，并将测序结果与金山醋酸乳杆菌基因序列进行比对，来确定待测样品中是否含有金山醋酸乳杆菌。
25、所述待测样品还可以为微生物菌体。微生物菌体可为单菌或混菌菌体，所述微生物包括但不限于植物乳杆菌、魏斯氏菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌和金山醋酸乳杆菌。
26、在区分金山醋酸乳杆菌与植物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于快速鉴定及定量检测金山醋酸乳杆菌的引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5中任一所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2中所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.特异性鉴定/定量检测金山醋酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-2所述的任一项引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于CRISPR-Cas12a的金山醋酸乳杆菌定量检测试剂盒，所述试剂盒中还包括crRNA、荧光报告探针和Cas12a蛋白；所述crRNA的核酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述荧光报告探针为双标记的单链DNA序列，5’端被标记为荧光基团，3’端被标记为猝灭基团。
5.权利要求1-2任一项所述的引物对或权利要求3-4任一项所述的试剂盒在鉴定和/或定量检测金山醋酸乳杆菌中的应用。
6.根据
7.一种特异性鉴定金山醋酸乳杆菌的方法，其特征在于，利用权利要求1-2任一项所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒，对待测样品中的核酸进行检测，通过凝胶电泳观察产物条带位置或测序结果对所述待测样本中金山醋酸乳杆菌进行鉴定。
8.一种特异性定量检测金山醋酸乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.一种基于CRISPR-Cas12a特异性定量检测金山醋酸乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述基于CRISPR-Cas12a特异性定量检测金山醋酸乳杆菌的方法，其特征在于，所述荧光强度检测所用激发波长为484 nm，发射波长为529 nm。
...【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴定及定量检测金山醋酸乳杆菌的引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1-5中任一所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如seq idno.2中所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
3.特异性鉴定/定量检测金山醋酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-2所述的任一项引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于crispr-cas12a的金山醋酸乳杆菌定量检测试剂盒，所述试剂盒中还包括crrna、荧光报告探针和cas12a蛋白；所述crrna的核酸序列如seq id no.9所示；所述荧光报告探针为双标记的单链dna序列，5’端被标记为荧光基团，3’端被标记为猝灭基团。
5.权利要求1-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：张翠英，林良才，孙丽静，王玥琦，殷利眷，刘素云，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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