【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种高催化活性的tet双加氧酶突变体、其编码基因、构建方法和应用。
技术介绍
1、dna甲基化是一种重要的表观遗传修饰，主要发生在哺乳动物基因组中的cpg岛上的胞嘧啶上。这种修饰涉及将甲基团添加到胞嘧啶的5号碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mc)。5mc在哺乳动物基因组中普遍存在，约占所有碱基的1％，并且在基因表达调控、细胞分化和疾病发生中起着关键作用。dna甲基化异常，包括高甲基化和低甲基化，与多种疾病，特别是癌症的发生发展密切相关。例如，抑癌基因启动子区域的异常高甲基化可能导致基因沉默，进而影响相关信号通路，促进癌症的发展。因此，dna甲基化不仅是肿瘤早期分子变化的重要标志，也是癌症早期诊断的潜在生物标志物。
2、传统的dna甲基化检测技术依赖于重亚硫酸盐转化法，该方法通过将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，从而区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶。然而，这种方法存在一些局限性，如对dna的损伤较大，转化效率低，且可能影响后续的pcr扩增和测序分析。近年来，酶转化法甲基化检测技术因其dna损伤小、准确性高和数据质量好等优点而受到关注。tet双加氧酶(ten-eleven translocation dioxygenases)是这一技术的核心，它们是一类在真核生物中发挥作用的双加氧酶，能够催化5mc的氧化过程，依次生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)和5-醛基胞嘧啶(5fc)并进一步氧化最终生成5-羧基胞嘧啶(5cac)，为dna甲基化分析提供了新的策略。然而，市场上现有的te
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中存在的tet双加氧酶存的制备难、成本高、活性低等的不足，提供一种高催化活性、易制备的tet双加氧酶突变体及其编码基因、构建方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术的第一方面，提供一种高催化活性的tet双加氧酶突变体，该tet双加氧酶突变体是通过将如seq id no.1所示的野生型tet双加氧酶的氨基酸序列按以下任意一种突变方式得到的：
3、a、235位异亮氨酸(i)突变为甲硫氨酸(m)；
4、b、235位异亮氨酸(i)突变为甲硫氨酸(m)且第150位脯氨酸(p)突变为丙氨酸(a)突变为甲硫氨酸。
5、优选的是，按照突变方式a得到的tet双加氧酶突变体记为i235m，其氨基酸序列为seq id no.3。
6、优选的是，按照突变方式b得到的tet双加氧酶突变体记为i235m/p150a或者是p150a/i235m，实施例中均记为p150a/i235m，其氨基酸序列为seq id no.4。
7、本专利技术的第二方面，提供一种编码所述的高催化活性的tet双加氧酶突变体的基因。
8、优选的是，编码如seq id no.1所示的野生型tet双加氧酶突变体的核苷酸序列为seq id no.2，编码所述的高活性的tet双加氧酶突变体的基因均是基于seq id no.2所示的核苷酸序列进行定点突变获得。
9、本专利技术的第三方面，提供一种包含如上所述的基因的重组质粒。
10、优选的是，所述重组质粒的质粒载体为pet-28a(+)或pet-22b(+)。
11、本专利技术的第四方面，提供一种包含如上所述的基因或是重组质粒的宿主细胞。
12、优选的是，所述宿主细胞为大肠杆菌。
13、本专利技术的第五方面，提供一种包含如上所述的tet双加氧酶突变体的可溶性蛋白或工程菌。
14、本专利技术的第六方面，提供一种如上所述的高催化活的tet双加氧酶突变体的构建方法，该方法包括以下步骤：培养所述的宿主细胞，通过诱导表达所述tet双加氧酶突变体，收集宿主细胞进行破碎和离心，从上清液中分离和纯化出所述的tet双加氧酶突变体。
15、本专利技术的第七方面，提供一种如上所述的高催化活性的tet双加氧酶突变体或宿主细胞或所述的可溶性蛋白或工程菌在催化5-甲基胞嘧啶(5mc)氧化生成5-羧基胞嘧啶(5cac)中的应用。
16、本专利技术的有益效果是：
17、本专利技术通过定点突变技术将来源于naegleria gruberi的tet双加氧酶(seq idno.1)的ngtet1的第235位异亮氨酸(i)突变为甲硫氨酸(m)、第150位脯氨酸(p)突变为丙氨酸(a)且第235位异亮氨酸(i)突变为甲硫氨酸(m)，获得了2种突变体(i235m和i235m/p150a)，这两种突变体将5mc转化为5cac的效率相比于野生型分别提升了230％和340％。且突变体在大肠杆菌表达体系中纯化效果好，显著降低了制备难度，具有广阔的应用前景。
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1.一种高催化活性的TET双加氧酶突变体，其特征在于，该TET双加氧酶突变体是通过将如SEQ ID NO.1所示的野生型TET双加氧酶的氨基酸序列按以下任意一种突变方式得到的：
2.根据权利要求1所述的高催化活性的TET双加氧酶突变体，其特征在于，按照突变方式a得到的TET双加氧酶突变体记为I235M，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3；
3.一种编码权利要求1-2中任意一项所述的高催化活性的TET双加氧酶突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码如SEQ ID NO.1所示的野生型TET双加氧酶突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，编码所述的高活性的TET双加氧酶突变体的基因均是基于SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行定点突变获得。
5.一种包含如权利要求3或4所述的基因的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的质粒载体为pET-28a(+)或pET-22b(+)。
7.一种包含如权利要求3或4所述的基因或是权利要求5或6所述的重组质粒的宿主
8.一种包含如权利要求1或2所述的TET双加氧酶突变体的可溶性蛋白或工程菌。
9.一种如权利要求1所述的高催化活的TET双加氧酶突变体的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：培养权利要求7所述的宿主细胞，通过诱导表达所述TET双加氧酶突变体，收集宿主细胞进行破碎和离心，从上清液中分离和纯化出所述的TET双加氧酶突变体。
10.一种如权利要求1或2所述的高催化活性的TET双加氧酶突变体或权利要求7所述的宿主细胞或权利要求7所述的可溶性蛋白或工程菌在催化5-甲基胞嘧啶氧化生成5-羧基胞嘧啶中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高催化活性的tet双加氧酶突变体，其特征在于，该tet双加氧酶突变体是通过将如seq id no.1所示的野生型tet双加氧酶的氨基酸序列按以下任意一种突变方式得到的：
2.根据权利要求1所述的高催化活性的tet双加氧酶突变体，其特征在于，按照突变方式a得到的tet双加氧酶突变体记为i235m，其氨基酸序列为seq id no.3；
3.一种编码权利要求1-2中任意一项所述的高催化活性的tet双加氧酶突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码如seq id no.1所示的野生型tet双加氧酶突变体的核苷酸序列为seq id no.2，编码所述的高活性的tet双加氧酶突变体的基因均是基于seq id no.2所示的核苷酸序列进行定点突变获得。
5.一种包含如权利要求3或4所述的基因的重组质...
【专利技术属性】
技术研发人员：郄兴旺，谭淼，马小娟，袁青，桂萍，
申请(专利权)人：苏州海苗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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