【技术实现步骤摘要】
本文公开的专利技术总体上涉及包括变异衣壳蛋白的腺相关病毒(aav)病毒粒子领域和使用定向进化技术产生这种变异衣壳。
技术介绍
1、肌肉与多种严重的遗传病症相关。肌肉是许多肌营养不良症的基因疗法中的靶组织，也可以用作生物工厂(biofactory)来产生分泌因子来治疗全身性疾病。将治疗基因递送到人类的肌肉组织可以认为是治疗肌肉相关疾病的未满足的最迫切需求。
2、实现肌肉定向的基因递送的一种方法是基于基因的腺相关病毒(aav)介导的疗法，其中使用重组腺相关病毒(raav)将基因递送到一种或多种肌细胞以例如替换缺失的基因、纠正显性缺陷基因、或提供用于连续蛋白质疗法的模板。虽然基于aav的临床基因疗法已经越来越成功，但是在病毒载体性质方面仍然存在缺点，包含例如以高效率靶向期望的肌细胞。因此，所属领域中需要具有优良转导能力的新颖aav变异体，其将提供更有效的基于基因的递送到肌细胞以治疗疾病。所属领域需要这种aav变异体，所述aav变异体呈现出增强的肌肉转导概况-与所属领域中已知的野生型aav和aav变异体相比，在某些情况下，所述aav变异体广泛地用于某些肌细胞类型，在其它情况下，所述aav变异体优先用于某些肌细胞类型。
3、天然存在的aav是单链dna病毒，其含有三个开放阅读框(open reading frame)，rep、cap和aap。第一个基因rep编码基因组复制必需的四种蛋白质(rep78、rep68、rep52和rep40)，第二个基因cap表达组装形成病毒衣壳的三种结构蛋白(vp1-3)，并且第三个基
4、体外和体内定向进化技术可以用于选择提供优于当前基于aav的基因递送载体的改良的aav变异体。这种定向进化技术是所属领域中已知的并且描述于例如pct公开wo2014/194132和kotterman&schaffer(《自然遗传学综述(nature review genetics)》，aop，2014年5月20日在线出版doi：10.1038/nrg3742)中，这两者均以全文引用的方式并入本文中。定向进化是一种衣壳工程改造方法，其通过多轮迭代的遗传多样化和选择过程模拟自然进化，由此能够积累逐步改良生物分子(如基于aav的病毒粒子)的功能的有益的突变。在此方法中，使野生型aav cap基因多样化以产生经包装以产生病毒颗粒库的较大基因库，并且施加选择性压力以分离具有可以克服基因递送障碍的优良表型的独特变异体。
5、以下已经公开了aav变异体：例如美国专利号9，193,9569；186；419；8,632,764；8,663,624；8,927,514；8,628,966；8,263,396；8,734,809；8,889,641；8,632,764；8,691,948；8,299,295；8,802,440；8,445,267；8,906,307；8,574,583；8,067,015；7,588,772；7,867,484；8，163,543；8,283,151；8,999,678；7,892,809；7,906,111；7,259,151；7,629,322；7,220,577；8,802,080；7，198,951；8,318,480；8,962,332；7,790,449；7,282,199；8,906,675；8,524,446；7,712,893；6,491,907；8,637,255；7，186,522；7，105,345；6,759,237；6,984,517；6,962,815；7,749,492；7,259,151和6，156,303；美国公开号2013/0295614；2015/0065562；2014/0364338；2013/0323226；2014/0359799；2013/0059732；2014/0037585；2014/0056854；2013/0296409；2014/03350542013/0195801；2012/0070899；2011/0275529；2011/0171262；2009/0215879；2010/0297177；2010/0203083；2009/0317417；2009/0202490；2012/0220492；2006/0292117和2004/0002159欧洲公开号2692731a1；2383346 b1；2359865 b1；2359866 b1；2359867 b1和2357010 b1；1791858 b1；1668143b1；1660678 b1；1664314 b1；1496944 b1；1456383 b1；2341068 b1；2338900 b1；1456419b1；1310571 b1；1456383 b1；1633772 b1和1135468 b1；和国际(pct)公开号wo 2014/124282；wo 2013/170078；wo 2014/160092；wo 2014/103957；wo 2014/052789；wo2013/174760；wo 2013/123503；wo 2011/038187和wo 2008/124015；wo 2003/054197；然而，这些参考文献没有公开本文所公开的aav变异体的实施例和/或特征和/或物质结构的组合物。
6、本文引用的和参考的专利文献中的所有文献和参考文献特此以引用的方式并入本文中。
技术实现思路
1、本文提供了变异腺相关病毒(aav)衣壳蛋白，其相对于亲代aav衣壳蛋白具有一种或多种氨基酸序列修饰，当存在于aav病毒粒子中时，与包括未经修饰的亲代aav衣壳蛋白的aav病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异aav衣壳蛋白赋予一种或多种类型的肌细胞增加的感染性。还提供了重组aav病毒粒子和包括如本文所描述的变异aav衣壳蛋白的其药物组合物；制备变异raav衣壳蛋白和病毒粒子的方法；以及在研究和临床实践中使用这些raav衣壳蛋白和病毒粒子的方法，例如将核酸序列递送到一种或多种肌细胞以治疗病症和疾病方面。
2、在本公开的一些方面，提供了变异腺相关病毒(aav)衣壳蛋白，这些变异aav衣壳蛋白相对于亲代aav衣壳具有一种或多种氨基酸序列修饰，当存在于aav病毒粒子中时，与包括不包括所述氨基酸序列修饰的亲代aav衣壳蛋白的aav病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异aav衣壳蛋白赋予一种或多种类型的肌细胞(例如骨骼肌细胞和/或心肌细胞)增加的感染性。在本公开的相关方面，当存在于aav病毒粒子中时，变异aav衣壳蛋白还赋予通过抗aav抗体对中和的增强的抗性。
3、在本公开的一些方面，提供了重组aav(raav)病毒粒子，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种选自以下组成的组的变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白：
2.一种变异AAV衣壳蛋白，其相对于亲代AAV衣壳蛋白包括肽插入，所述肽插入对应于AAV2的VP1的氨基酸570与611之间的位置处的两个相邻氨基酸，其中所述插入包括氨基酸序列Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3，并且其中Y1-Y3中的每一个，如果存在，独立地选自Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Pro；X1选自Ala、Asn、Thr、Gly、Ser、Ala、Gln和Asp；X2选自Lys、Asn、Thr、Ser、Ala和Gln；X3选自Ile、Thr、Lys、Leu、Val、Asn、Asp和Arg；X4选自Gln、Thr、Ile、Lys、Val、Ser和Tyr；X5选自Arg、Asn、Gly、Lys、Leu、Thr、Ala、Ser和Gln；X6选自Thr、Lys、Val、Gly、Ser、Ala、Arg和Pro；并且X7选自Asp、Thr、Asn、Ile、Ala和Ser。
3.根据权利要求2所述的变异AAV衣壳蛋白，其中X1选自Thr和Asn；X2选自Asn和Lys；X3选自Lys、I
4.根据权利要求1到3中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括肽插入，其中所述插入位点位于对应于AAV2的VP1的氨基酸587与588的氨基酸之间或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的相应位置。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包括肽插入，并且其中所述肽插入包括氨基酸序列NKIQRTD(SEQ ID NO：13)或LANKIQRTDA(SEQ IDNO：26)。
6.根据权利要求5所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQ IDNO：2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的相应位置包括V708I氨基酸取代。
7.根据权利要求6所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQ IDNO：2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的一个或多个相应位置进一步包括S109T氨基酸取代、R588M氨基酸取代和A593氨基酸取代中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQ IDNO：2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的一个或多个相应位置进一步包括A35P氨基酸取代。
9.根据权利要求6所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO：43中所示的氨基酸序列的整个长度有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1到4中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包括肽插入，并且其中所述肽插入包括氨基酸序列NKTINKD(SEQ ID NO：14)或LANKTTNKDA(SEQID NO：27)。
...【技术特征摘要】
1.一种选自以下组成的组的变异腺相关病毒(aav)衣壳蛋白：
2.一种变异aav衣壳蛋白，其相对于亲代aav衣壳蛋白包括肽插入，所述肽插入对应于aav2的vp1的氨基酸570与611之间的位置处的两个相邻氨基酸，其中所述插入包括氨基酸序列y1y2x1x2x3x4x5x6x7y3，并且其中y1-y3中的每一个，如果存在，独立地选自ala、leu、gly、ser、thr、pro；x1选自ala、asn、thr、gly、ser、ala、gln和asp；x2选自lys、asn、thr、ser、ala和gln；x3选自ile、thr、lys、leu、val、asn、asp和arg；x4选自gln、thr、ile、lys、val、ser和tyr；x5选自arg、asn、gly、lys、leu、thr、ala、ser和gln；x6选自thr、lys、val、gly、ser、ala、arg和pro；并且x7选自asp、thr、asn、ile、ala和ser。
3.根据权利要求2所述的变异aav衣壳蛋白，其中x1选自thr和asn；x2选自asn和lys；x3选自lys、ile和thr；x4选自ile、gln和thr；x5选自gly、arg和asn；x6选自val、thr和lys；并且x7选自thr和asp。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的变异aav衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括肽插入，其中所述插入位点位于对应于aav2的vp1的氨基酸587与588的氨基酸之间或另一种aav血清型的所述衣壳蛋白中的相应位置。
【专利技术属性】
技术研发人员：D·H·柯恩，M·科特曼，D·谢弗，
申请(专利权)人：四D分子治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：
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