【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫，具体涉及一组抗人gpc3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用。
技术介绍
1、glypian-3(gpc3)是一种硫酸肝素蛋白聚糖(hspg)，由580个氨基酸组成的65kd蛋白质。gpc3蛋白通过glycosylphosphatidylinositol(gpi)锚连接到细胞膜，14个保守半胱氨酸残基，最后50个残基由硫酸肝素(hs)侧链修饰。这种蛋白质在健康胎儿的肝脏和肾脏中表达，但在成人中除了胎盘组织其它组织几乎不表达。有研究表明gpc3在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(wilms瘤)、卵黄囊瘤和一些儿科癌症中特异性表达。尽管gpc3的确切功能尚不清楚，但已强烈暗示其与hcc的恶变有关。因此，gpc3被确定为癌症免疫治疗的有希望的靶点。
2、1989年，著名科学家gross g、waks t和eshharz在一项研究中，将表达特定抗体的基因序列赋予细胞毒性t细胞，这使得t细胞实现了抗原特异性的、非mhc限制的活化及其效应的增强。他们认为：“赋予t细胞一个嵌合的抗原受体，将是未来人类对抗肿瘤的一种重要途径。”这便是人类历史上，首次提出car这一概念。car-t治疗又称嵌合抗原受体(car)t细胞治疗，是将人的t细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，用于治疗疾病。
3、然而随着研究的深入和临床应用的不断增多，car-t治疗过程中所产生的弊端也逐渐被认识和关注，如移植物抗宿主反
4、car-nk细胞比car-t细胞具有多个优势：与car-t细胞不同，car-nk细胞保留了通过其天然受体识别和靶向肿瘤细胞的内在能力，从而通过car-nk靶向治疗时，肿瘤细胞能够逃脱杀伤的可能性降低；car-nk细胞在数天至数周内不会发生免疫排斥反应。因此，它们在许多临床试验中均未表现出car-t的安全问题，例如没有细胞因子释放综合征的困扰；nk细胞不需要严格的hla匹配，并且没有引起移植物抗宿主病的潜力，这却是car-t细胞免疫疗法一种重要的风险。
5、何苗壮等人在cn 105968209 a中公开了一种抗gpc3的纳米抗体，但其亲和力较低，后续应用受限。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一组抗人gpc3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用，所述纳米抗体突变体与靶标具有更强的结合能力，更适合car-nk技术的应用。
2、本专利技术提供了一组抗gpc3的纳米抗体突变体，所述纳米抗体突变体较所述抗gpc3的纳米抗体具有更高的gpc3亲和力；
3、所述抗gpc3的纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.9所示。
4、优选的，所述纳米抗体突变体包括以下任一种：氨基酸序列依次如seq idno.1～seq id no.4所示的突变体1-2、突变体2-2、突变体3-2和突变体4-2。
5、优选的，所述纳米抗体突变体的核苷酸序列依次如seq id no.5～seq idno.8所示。
6、本专利技术还提供了基于上述纳米抗体突变体的靶向gpc3的嵌合抗原受体。
7、优选的，所述嵌合抗原受体的结构，包括依次连接的信号肽、抗体区、铰链区、跨膜区和胞内区。
8、优选的于，所述信号肽的来源包括人cd8a信号肽；
9、所述抗体区包括一条突变体序列或利用柔性连接肽连接的两条突变体序列；
10、所述铰链区的来源包括人igg4或人cd8a；
11、所述跨膜区的来源包括人cd28或人cd8a；
12、所述胞内区的来源包括人41bb或cd3。
13、本专利技术还提供了利用上述嵌合抗原受体的核苷酸扩增得到的线性双链基因，所述扩增用的引物包括核苷酸序列如seq id no.11所示的上游引物和seq id no.12所示的下游引物。
14、本专利技术还提供了利用上述线性双链基因为模板经体外转录得到的mrna。
15、本专利技术还提供了一种基因工程改造的car-nk细胞，所述car-nk细胞由上述mrna转化nk细胞后得到，并表达上述纳米抗体突变体。
16、本专利技术还提供了上述纳米抗体突变体或上述嵌合抗原受体或上述car-nk细胞在制备治疗患有表达gpc3的癌症的受试者的药物中的应用。
17、有益效果：本专利技术提供了一组抗gpc3的纳米抗体突变体，对现有的抗cpg3纳米抗体(nh3)进行突变，从而提高抗体的亲和力，实施例中利用4个突变后的抗gpc3抗体与nh3母本抗体(1-2、2-2、3-2、4-2和nh3母本抗体)进行比较，1-2、2-2、3-2三个抗体的ec50值均较母本抗体nh3低，表示具有更强的结合能力。
18、本专利技术还基于所述纳米抗体突变体构建了嵌合抗原受体，同时合成了所述纳米抗体突变体的双链dna作为体外转录生产mrna的模板，再利用所述mrna对nk细胞进行基因工程改造，从而得到car-nk细胞。本专利技术所述car-nk细胞中，mrna均可以在nk细胞上有效表达car分子，并具有更强烈的体外杀伤能力，表现出更好的抗肝癌效果。
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1.一组抗GPC3的纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体较所述抗GPC3的纳米抗体具有更高的GPC3亲和力；
2.根据权利要求1所述纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体包括以下任一种：氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示的突变体1-2、突变体2-2、突变体3-2和突变体4-2。
3.根据权利要求2所述纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体的核苷酸序列依次如SEQ ID No.5～SEQ ID No.8所示。
4.基于权利要求1～3任一项所述纳米抗体突变体的靶向GPC3的嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构，包括依次连接的信号肽、抗体区、铰链区、跨膜区和胞内区。
6.根据权利要求5所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽的来源包括人CD8a信号肽；
7.利用权利要求4～6任一项所述嵌合抗原受体的核苷酸扩增得到的线性双链基因，其特征在于，所述扩增用的引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的上游引物
8.利用权利要求7所述线性双链基因为模板经体外转录得到的mRNA。
9.一种基因工程改造的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞由权利要求8所述mRNA转化NK细胞后得到，并表达权利要求1～3任一项所述纳米抗体突变体。
10.权利要求1～3任一项所述纳米抗体突变体或权利要求4～6任一项所述嵌合抗原受体或权利要求9所述CAR-NK细胞在制备治疗患有表达GPC3的癌症的受试者的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一组抗gpc3的纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体较所述抗gpc3的纳米抗体具有更高的gpc3亲和力；
2.根据权利要求1所述纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体包括以下任一种：氨基酸序列依次如seq id no.1～seq id no.4所示的突变体1-2、突变体2-2、突变体3-2和突变体4-2。
3.根据权利要求2所述纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体的核苷酸序列依次如seq id no.5～seq id no.8所示。
4.基于权利要求1～3任一项所述纳米抗体突变体的靶向gpc3的嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构，包括依次连接的信号肽、抗体区、铰链区、跨膜区和胞内区。
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【专利技术属性】
技术研发人员：蔡俊，袁翰，滕毓敏，李斯慧，张艳玲，
申请(专利权)人：艾可泰科浙江控股有限公司，
类型：发明
国别省市：
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