【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物，具体涉及一种胶体金同时标记dna与抗体的构建方法。
技术介绍
1、金纳米颗粒（aunps），指的是直径在1-100 nm的金的微小颗粒，通常以胶体金的形态存在于水溶液中，被认为是最稳定的金属纳米颗粒，具有生物相容性（生物惰性和低细胞毒性）。纳米金由于其超小尺寸和高表面积体积比使其具有突出的优势，纳米金可以被各种分子功能化，包括多糖、蛋白质、肽、脂肪酸、质粒或寡核苷酸等，从而使其广泛地应用于各种生物传感技术和检测系统。免疫胶体金技术是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应进行的固相标记免疫技术，继荧光素、放射性同位素和酶检测技术之后，免疫胶体金技术已广泛应用于生物医学免疫组织化学和细胞生物学等研究领域。胶体金标记原理实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，吸附的机理可能是胶体金表面所带的负电荷与蛋白质分子所带的正电荷之间靠静电力相互吸引，达到范德华引力内即形成牢固的结合，另外，胶体金颗粒的粗糙也是有利于形成吸附的重要条件，由于这种标记过程主要是靠物理吸附作用，因而对蛋白质分子的生物学活性没有明显影响。目前，关于胶体金同时标记抗体和dna的制备方法还很少，且花费的时间长。
技术实现思路
1、针对上述存在的缺陷和问题，本专利技术提供一种胶体金同时标记dna与抗体的构建方法，通过筛选最佳ph值将胶体金与抗体相连接，通过冻融法将dna寡核苷酸固定在胶体金颗粒上，最终通过冻融法结合静电吸附将dna寡核苷酸与抗体及胶体金连接在一起，构建成核酸-抗体
2、本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一种胶体金同时标记dna与抗体的构建方法，包括以下步骤：
3、（1）测定胶体金标记抗体最适ph值：
4、（2）制备胶体金标记dna：采用冻融法将巯基修饰的寡核苷酸a-i（dna）固定至金颗粒表面，作为胶体金-核酸复合物（au-a-i）备用；
5、（3）检测胶体金标记dna的效果；
6、（4）制备胶体金标记dna和抗体：通过冻融法和静电吸附法制备胶体金-核酸-抗体复合物；
7、（5）检测胶体金标记dna和抗体的效果；
8、（6）处理并检验实验数据。
9、进一步的，所述步骤（1）中，测定胶体金标记抗体最适ph值的步骤为：
10、s11、取3只离心管，分别加入1 ml胶体金，使用0.2mol/l的k2co3将其ph分别调整为7、8、9；
11、s12、取96孔板依次加入不同ph值的胶体金，每孔100μl，并在每孔加入2 μl 1 mg/ml的抗gapdh单克隆抗体溶液，混匀后，室温下静置15 min；
12、s13、每孔加入20μl 10%的nacl溶液，混匀后室温下静置10 min；
13、s14、观察孔中颜色变化，记录维持溶液红色的最低ph值。
14、进一步的，所述步骤（2）中，具体操作步骤如下：
15、s21、取1ml胶体金至玻璃瓶中，使用0.2 mol/l的k2co3将其ph调节调整为7.5；
16、s22、用4μl 2 mmol/l的tcep活化8μl a-i，混匀后室温反应30 min；
17、s23、将活将后的a-i滴加到200μl胶体金溶液中；
18、s24、将胶体金核酸混合液置于-20℃冰箱中冷冻1 h后取出融化，置于离心机中以13000 r/min离心5 min；
19、s25、弃去上清后用200μl 0.01 mol/l pbs复溶，再以13000r/min离心5 min；
20、s26、弃去上清后用400μl 0.01 mol/l pbs溶解，作为胶体金-核酸复合物备用。
21、进一步的，所述步骤（3）中，胶体金标记dna效果的检测步骤如下：
22、s31、取黑色酶标板，第1孔中加入50μl au-a-i和各1μl a-h1和a-h2，用pbs缓冲液补齐至100 μl；
23、s32、第2孔中加入1.5μl tcep活化a-i和各1μl a-h1和a-h2，用pbs缓冲液补齐至100 μl；
24、s33、第3孔中加入1μl a-i和各1μl a-h1和a-h2，用pbs缓冲液补齐至100 μl；
25、s34、第4孔中加入各1μl a-h1和a-h2，用pbs缓冲液（5 nm mg2+）补齐至100μl；
26、s35、37℃恒温培养箱中反应1h，用多功能酶标仪对结果进行检测，收集结果数据。
27、进一步的，所述步骤（4）的具体操作步骤如下：
28、s41、取1ml胶体金至玻璃瓶中，使用0.2 mol/l的k2co3将其ph调整为7.5；
29、s42、用4μl 2 mmol/l的tcep活化8μl a-i，混匀后室温反应30 min；
30、s43、将活化后的a-i滴加到200μl胶体金溶液中，将胶体金核酸混合液置于-20℃冰箱中冷冻1h后取出融化；
31、s44、将4μl 抗gapdh mab（1mg/ml）滴加到胶体金核酸混合液中，室温震荡孵育4h；
32、s45、孵育结束后，将22 ul 10% bsa溶液与胶体金-核酸-抗体混合液充分混合，并在室温下混合30min以封闭多余的位点；
33、s46、封闭混合结束后，将反应产物置于离心机中以13000 r/min离心5 min，弃去上清后用200μl 0.01 mol/l pbs复溶，再以13000 r/min离心5 min，弃去上清后用200μl0.01 mol/l pbs溶解，作为胶体金-核酸-抗体复合物备用。
34、进一步的，所述步骤（5）的检测流程如下：
35、s51、取黑色酶标板，第1孔中加入50μl au-a-i-mab和各1μl a-h1和a-h2，用pbs缓冲液补齐至100μl；
36、s52、第2孔中加入50μl au-a-i和各1μl a-h1和a-h2，用pbs缓冲液，补齐至100μl；
37、s53~s55的步骤与s33~s35的步骤相同；
38、s56、将50 ul含gapdh抗原的pk-15细胞裂解液包被于黑色酶标板孔中，4℃孵育过夜，pbst洗板3次并拍干；
39、s57、用快速封闭液i（200 ul/孔）室温孵育30 min，pbst洗板3次并拍干；
40、s58、分别向孔中加入50 ul au-a-i-mab、au-a-i或pbs，室温孵育1 h，pbst洗板5次并拍干；
41、s59、加入各1μl a-h1和a-h2，用pbs缓冲液补齐至100μl；
42、s510、37℃恒温培养箱中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胶体金同时标记DNA与抗体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记DNA与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，测定胶体金标记抗体最适pH值的步骤为：
3.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记DNA与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，具体操作步骤如下：
4.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记DNA与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，胶体金标记DNA效果的检测步骤如下：
5.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记DNA与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）的具体操作步骤如下：
6.根据权利要求4所述的一种胶体金同时标记DNA与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（5）的检测流程如下：
7.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记DNA与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）中，实验重复进行多次，结果为多次重复的均数±标准差（SD），数据采用SPSS软件进行单因素方差分析和Bonferroni事后检验。
【技术特征摘要】
1.一种胶体金同时标记dna与抗体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记dna与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，测定胶体金标记抗体最适ph值的步骤为：
3.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记dna与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，具体操作步骤如下：
4.根据权利要求1所述的一种胶体金同时标记dna与抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，胶体金标记dna效果的检测步骤如...
【专利技术属性】
技术研发人员：董望，吕慧芳，井汇源，李华玮，彭志锋，宋幸辉，王金合，王海花，唐光武，张艳，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：
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