【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物样本制备，尤其涉及微小尺寸显微生物样品激光切片装置及其方法。
技术介绍
1、在空间组学研究中，生物学样品需要被制成切片后才能进行成像与组学分析工作。对于常规的大尺寸的生物样品，如小鼠脑、植物根茎等，先制成切片后再进行成像与组学分析。但对于小尺寸且对时空特性要求高的样本，如胰岛等，则需要先进行成像后再切片进行组学分析。由于使用振荡切片机或冰冻切片机等常规切片方法会造成样品的挤压与牵拉，造成样品损失过多且不易进行三维重构。同时常出现样本在刀片上产生粘贴卷曲的现象，使得切下样本难以被收集。此外，现有切片机在样本制备前需要进行样品包埋，切割时依赖操作员人眼观察，导致小样本难以进行切片作业。以上的情况，都会造成样品损失，尤其是珍贵的病理样本。因此需要专利技术一种装置对50μm至500μm直径的小尺寸生物样本进行可靠的非接触式切片作业。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种可以进行小尺寸生物样品激光切片作业的装置及其激光切片方法，用以克服小尺寸生物样品在使用现有切片装置时可能产生的样本形变、样本损失、制备困难等风险，以减少时间、实验和样本损失。通过小尺度生物样品切片作业装置的设计和制作，可以为有需要的实验室提供一种样本制备方案，提高空间组学实验效率与成功率。
2、为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种生物样品激光切片装置，可进行小尺度生物样品激光切片作业，该激光切片装置包括超快激光器、激光束运动控制组件、镜头、样品舱，其中，
4、所述超快激光器为可发射750nm至1100nm超快激光的近红外激光器，其激光能量范围50nj至3mj，以重复频率1khz至1ghz的脉冲形式作用于样品，可以实现对样品的冷加工，保护焦外样品不受损伤。
5、所述激光束运动控制组件可以是可控制超快激光器发射及扫描方向的高斯光运动的光学器件组，包含导光光路，其中具体含有反射镜、扩束器、三维扫描器等，反光镜将超快激光器发射的激光束引导到加工装置，并引导激光束进入扩束器，实现所需光斑尺寸，再由三维扫描器带动激光光束进行三维扫描。反射镜的选择需要减少激光能量损失，可以选用介质膜高反射率反射镜或者金属反射镜，形式可以为分立式器件或者集成起来的导光管。扩束器将激光器发射的光束与后续选用的显微物镜的尾孔径进行匹配，以确保可以实现设计的光斑尺寸，因而需要选择合适的放大倍率，同时在使用中需要确保与光路完全同轴。三维扫描器带动光束在目标样品上进行所设计的三维扫描，实现切割动作，三维扫描器包含二维扫描器例如二维振镜，二维扫描器控制光束在其正交平面(yz平面)内进行扫描，其选择需要与所选用物镜的视场匹配；三维扫描器还需包含纵向扫描器，可以是精密电控平移台或者压电促动平台，安装在显微物镜上，带动镜头做短距离高精度的纵向扫描。使用高斯光做切割光源时，光斑xy方向大小在理论上可达到1μm以下。
6、所述激光束运动控制组件还可以是可将超快激光器发射激光调制为无衍射贝塞尔光片并控制其运动的光学器件组，具体包含前述反射镜、扩束器、二维扫描器，另外需包含相位调制器件，具体的，相位调制器件包含并不限于角锥棱镜(axicon)、液晶空间光调制器(lc-slm)、数字微镜调制器(dmd)。反光镜使超快激光器发射的激光进入扩束器，实现所需光斑尺寸；相位调制器件将原始的高斯光波调制为锥形相位光波，通过所述镜头之后，光束变换为细长的贝塞尔光束，结合二维扫描器的扫描动作即可形成贝塞尔光片，以实现大深度的切割动作。使用贝塞尔光做切割光源时，所形成无衍射贝塞尔光片厚度在理论上可达到2μm以下。使用高斯光和贝塞尔光这两种切割光源均可实现对样品的微损切割(切割厚度小于20μm，即典型细胞厚度)。
7、所述镜头为工作距离在0.5cm至1.5cm的数值孔径在0.6至1的镜头。
8、优选的，所述样品舱的框架由底板和位于底板上的多根立柱构成，其中底板可以是塑料材质，立柱为外包硅胶的塑料柱，每根立柱上设有两条滑道；该框架配合可更换的透明塑料膜(例如折射率和水接近的fep膜)、塑料片(如fep片)或玻璃片组成的舱壁，形成上端开口的容器，其中，透明塑料膜可以缠绕在立柱上，缝隙处使用粘合剂(如组织粘合剂或牙科水泥)实现密封；塑料片或玻璃片可以插入立柱的滑道中，利用滑道材料本身的弹力和/或粘合剂(如组织粘合剂或牙科水泥)实现密封。在本专利技术的一些实施例中，所述样品舱框架底板为长方形，四个角上设有四根立柱，使用4件塑料片或玻璃片插入立柱滑道中，组合形成上端开口的长方体容器。
9、在进行激光切片作业中，对于具有生物活性的样品需要在样品舱中加入匹配介质，所述匹配介质为对样品无损伤且与样品折射率差异小于±10％的液体或胶体。
10、相比于已有切片装置，本专利技术的生物样品激光切片装置使用激光进行样品切割，不会在切片时对样品造成挤压与牵拉，不会产生样品在切割刀片上的粘贴卷曲，从而保证样品的完整性，尤其适用于小尺寸生物样品的激光切片作业。
11、本专利技术还提供了利用上述生物样品激光切片装置对小尺寸生物样品进行激光切片的方法，包括以下步骤：
12、对于具有生物活性的样品：
13、1、配制匹配介质溶液。配制培养样品用的等渗溶液，配置完成后向等渗溶液中泵入由95％o2与5％co2组成的混合气，使等渗溶液中o2充分饱和。用阿贝折射仪测定此时等渗溶液折射率。等渗溶液折射率一般在1.30至1.40之间。此时，若样品舱壁材质为盖玻片玻璃插片，可向等渗溶液中加入适量蔗糖溶液，调整其折射率至1.41±0.01，所得液体为匹配介质溶液；若样品舱壁材质为fep膜，则可直接将等渗溶液作为匹配介质使用。
14、2、制作样品舱。如图2所示，若样品舱壁材质为盖玻片玻璃插片，可直接在样品舱框架立柱间插入，缝隙处使用组织粘合剂或牙科水泥黏合密封；若样品舱壁材质为fep膜，可将fep膜缠绕在样品舱框架立柱，缝隙处使用组织粘合剂或牙科水泥黏合密封。
15、3、样品放置。根据实验目的要求，将氧饱和的匹配介质经冰水混合物预冷或调整温度至室温或调整温度至生物体温。由生物活体通过手术手段取出待切片样品，或取出培养箱中预先培养的样品，如有必要用手术刀对样品进行修型，之后将样品用生物胶或502(如实验方法许可)固定至样品舱底部载玻片上。迅速倒入氧饱和的匹配介质。
16、4、样品切片与后处理。将样品舱放入本专利技术的激光切片装置中，调整样品与镜头之间的距离至镜头标定的工作距离。根据实验要求激光束运动控制组件配套程序设定激光束行进路线、功率及工作时间，开机，对样品进行切片。切好的样品可按实验需求通过孵育框迅速转移至35℃等渗溶液中恢复，半小时后可用于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物样品激光切片装置，用于进行小尺度生物样品激光切片作业，该激光切片装置包括超快激光器、激光束运动控制组件、镜头和样品舱，其中，所述超快激光器与激光束运动控制组件通过导光管连接，激光通过导光管从超快激光器进入激光束运动控制组件；镜头通过镜头座与激光束运动控制组件外壳相连，激光通过镜头射入样品舱，对样品进行切片；所述样品舱为由框架与可更换的透明塑料或玻璃舱壁组成的上端开口的容器。
2.根据权利要求1所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述样品舱的框架由底板和位于底板上的多根立柱构成，每根立柱上设有两条滑道；所述可更换的透明塑料或玻璃舱壁为FEP膜、FEP片或玻璃片，FEP片或玻璃片插入立柱滑道中，利用滑道材料本身的弹力和/或粘合剂实现密封，或者将FEP膜缠绕在立柱上，缝隙处使用粘合剂实现密封。
3.根据权利要求2所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述样品舱的框架包括长方形塑料底板及其四个角上的四根立柱，立柱为外包硅胶的塑料柱；所述粘合剂为组织粘合剂或牙科水泥。
4.根据权利要求1所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述超快激
5.根据权利要求1所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述激光束运动控制组件为控制超快激光器发射及扫描方向的高斯光运动的光学器件组，或者是将超快激光器发射激光调制为无衍射贝塞尔光片并控制其运动的光学器件组。
6.根据权利要求5所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述激光束运动控制组件包括反射镜、扩束器、三维扫描器，其中，反光镜将超快激光器发射的激光束引导进入扩束器，实现所需光斑尺寸，再由三维扫描器带动激光光束进行三维扫描；所述三维扫描器包含二维扫描器和纵向扫描器，二维扫描器控制光束在其正交平面内进行扫描，纵向扫描器是精密电控平移台或者压电促动平台，带动镜头做短距离高精度的纵向扫描。
7.根据权利要求5所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述激光束运动控制组件包括反射镜、扩束器、相位调制器件和二维扫描器，其中，反光镜使超快激光器发射的激光进入扩束器，实现所需光斑尺寸；相位调制器件将原始的高斯光波调制为锥形相位光波，通过所述镜头之后，光束变换为细长的贝塞尔光束，二维扫描器控制贝塞尔光束在平面内进行扫描。
8.根据权利要求1所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述镜头为工作距离在0.5cm至1.5cm的数值孔径在0.6至1的镜头。
9.一种对小尺寸生物样品进行激光切片的方法，利用权利要求1～8任一所述的生物样品激光切片装置实现，其中，对于具有生物活性的样品，将样品放入具有可更换的透明塑料或玻璃舱壁的样品舱中并固定后加入匹配介质，然后将样品舱放入激光切片装置中进行激光切片操作；对于无生物活性的样品，直接将样品固定在只有框架的样品舱中，然后将样品舱放入激光切片装置中进行激光切片操作。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述匹配介质为对样品无损伤且与样品折射率差异小于±10％的液体或胶体，优选的，所述匹配介质为氧饱和的等渗溶液，使用前经冰水混合物预冷或调整温度至室温或调整温度至生物体温。
...【技术特征摘要】
1.一种生物样品激光切片装置，用于进行小尺度生物样品激光切片作业，该激光切片装置包括超快激光器、激光束运动控制组件、镜头和样品舱，其中，所述超快激光器与激光束运动控制组件通过导光管连接，激光通过导光管从超快激光器进入激光束运动控制组件；镜头通过镜头座与激光束运动控制组件外壳相连，激光通过镜头射入样品舱，对样品进行切片；所述样品舱为由框架与可更换的透明塑料或玻璃舱壁组成的上端开口的容器。
2.根据权利要求1所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述样品舱的框架由底板和位于底板上的多根立柱构成，每根立柱上设有两条滑道；所述可更换的透明塑料或玻璃舱壁为fep膜、fep片或玻璃片，fep片或玻璃片插入立柱滑道中，利用滑道材料本身的弹力和/或粘合剂实现密封，或者将fep膜缠绕在立柱上，缝隙处使用粘合剂实现密封。
3.根据权利要求2所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述样品舱的框架包括长方形塑料底板及其四个角上的四根立柱，立柱为外包硅胶的塑料柱；所述粘合剂为组织粘合剂或牙科水泥。
4.根据权利要求1所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述超快激光器为发射750nm至1100nm超快激光的近红外激光器。
5.根据权利要求1所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述激光束运动控制组件为控制超快激光器发射及扫描方向的高斯光运动的光学器件组，或者是将超快激光器发射激光调制为无衍射贝塞尔光片并控制其运动的光学器件组。
6.根据权利要求5所述的生物样品激光切片装置，其特征在于，所述激光束运动控制组件包括反射...
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