【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及抗h10亚型流感病毒血凝素蛋白中和性单克隆抗体的制备及应用。
技术介绍
1、甲型流感病毒的感染范围非常广泛，包括人、猪、马和禽类等。流感病毒通过空气传播，感染宿主后会在呼吸道内复制，引发发热、咳嗽、肌肉疼痛等流感症状。由于其高变异性，甲型流感病毒常常会引起季节性和大规模流行，尤其是在每年的冬春季节。h10亚型流感病毒就是甲型流感病毒的一种，近年来在全球范围内的禽类中被频繁检测到，全球多个地区也出现并报道了人类散发感染h10亚型流感病毒甚至致死的病例。由于近年来h10亚型流感病毒在全球禽类中持续传播，感染人类的病例也频繁出现，因此，研发高效的抗病毒药物对于疾病防控具有重要意义。目前随着临床药物的广泛使用，出现了一定的耐药现象，随着耐药率的不断升高、治疗时间窗(48小时内用药)受限，寻求新型针对流感感染的治疗药物迫在眉睫。单克隆抗体因其具有高度的特异性和良好的安全性而得到广泛的应用，一些单克隆抗体药物已被批准用于预防和治疗各种传染病的临床试验，例如帕利珠单克隆抗体预防呼吸道合胞病毒感染。
2、基于以上背景，本项目选定h10亚型流感病毒血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定单克隆抗体。该中和性单克隆抗体的成功获得，为治疗h10亚型流感病毒感染提供新手段。
3、本专利技术用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的b淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供用于治疗h10亚型流感的抗h10亚型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体。
2、一种抗h10亚型流感病毒血凝素蛋白中和性单克隆抗体1e10，该单克隆抗体亚型为igg2b、κ型，能与h10亚型流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合，抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no.2，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。
3、seq id no.1
4、heavy chain:dna sequence(375bp)
5、signal sequence-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
6、caggttactctgaaagagtctggccctgggatattgcagccctcccagaccctcagtct
7、gacttgttctttctctgggttttcactgagcacatctggtatgggtgtgagctggattc
8、gtcagccttcaggaaagggtctggagtggctggcacacatttactgggatgatgacaa
9、gcgctataatccatccctgaagagccggctcacaatctccaaggatacctccagaaacc
10、aggtattcctcaagatcaccagtgtggacactgcagatactgccacatactactgtgct
11、cgaagtccccctacggactacggtagtagctggggtgttatggactattggggtcaagg
12、aacctcaatcaccgtctcctca
13、seq id no.2
14、heavy chain:amino acid sequence(125aa)
15、signal peptide-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
16、qvtlkesgpgilqpsqtlsltcsfsgfslstsgmgvswirqpsgkglewlahiywdddkry
17、npslksrltiskdtsrnqvflkitsvdtadtatyycarspptdygsswgvmdywgqgtsit
18、vss
19、seq id no.3
20、light chain:dna sequence(318bp)
21、signal sequence-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
22、caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcac
23、catgacctgcagtgccagttcaagtgtaacttacatgcactggtaccagcagaagtca
24、ggcacctcccccaaaaggtggatttatgacacatccacactggcttctggagtccctgc
25、tcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcaccagcatggag
26、gctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccgctcacgttcgg
27、tgctgggaccaagctggagctgaaa
28、seq id no.4
29、light chain:amino acid sequence(106aa)
30、signal peptide-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
31、qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvtymhwyqqksgtspkrwiydtstlasgvparf
32、sgsgsgtsysltitsmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk
33、本专利技术的第二个目的提供抗h10亚型流感病毒血凝素蛋白中和性单克隆抗体1e10的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：
34、(1)动物的免疫：选择6周龄的balb/c小鼠，以纯化的h10n7亚型流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫。血凝素蛋白由h10n7亚型流感病毒株(a/chicken/zhejiang/2cp8/2014)接种鸡胚，培养并收获病毒液，经甲醛灭活、纯化、裂解及再纯化等方法，以磷酸缓冲液稀释制备获得。
35、(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞sp2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。
36、(3)细胞融合：采用聚乙二醇融合法。以balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种balb/c小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。将(1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集(2)中的小鼠骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养。
37、(4)杂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗H10亚型流感病毒血凝素蛋白中和性单克隆抗体1E10，该单克隆抗体亚型为IgG2b、κ型，能与H10亚型流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合，抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的中和性单克隆抗体1E10，其特征在于：所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生。
3.根据权利要求2所述的中和性单克隆抗体1E10，其特征在于：产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系1E10，能稳定分泌抗H10亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1E10。
4.权利要求1所述的抗H10流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1E10的制备方法，其特征在于该单克隆抗体通过的以下步骤获得：
5.权利要求1或2所述的中和性单克隆抗体1E10在制备预防或治疗H10亚型流感药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物通过病毒中和作用治疗H10亚型流感病
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物的治疗剂量为3或10毫克每千克体重。
8.一种预防或治疗H10亚型流感的药物，包含权利要求1或2所述的中和性单克隆抗体1E10。
9.一种预防或治疗H10亚型流感的药盒，其特征在于：含3或10毫克的整数倍剂量的权利要求1或2所述的中和性单克隆抗体1E10。
...【技术特征摘要】
1.一种抗h10亚型流感病毒血凝素蛋白中和性单克隆抗体1e10，该单克隆抗体亚型为igg2b、κ型，能与h10亚型流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合，抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no.2，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。
2.根据权利要求1所述的中和性单克隆抗体1e10，其特征在于：所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生。
3.根据权利要求2所述的中和性单克隆抗体1e10，其特征在于：产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的balb/c小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系1e10，能稳定分泌抗h10亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1e10。
4.权...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴海波，王娉，姚航平，吴南屏，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院浙江省第一医院，
类型：发明
国别省市：
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