【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种耐酸库德里亚兹毕赤酵母及其应用。
技术介绍
1、丁二酸，又名琥珀酸，是一种重要的c4平台化合物，作为合成通用化学品的起始原料，琥珀酸在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用，
2、目前丁二酸的生产主要有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法包括石蜡氧化法、氯乙酸甲酯氰化水解法和五氧化二钒催化加氢法等，但由于石油资源的减少和环境污染日益严重等问题，化学合成方法的弊端日益显现。而通过发酵法生产丁二酸，能够利用可再生资源，对环境污染小，展现出良好的发展前景。在微生物发酵法中研究较多的产丁二酸的菌种包括产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等。但大多数细菌菌株需要接近中性ph环境才能获得最佳的发酵性能，丁二酸发酵时会产生大量有机酸，而有机酸的积累会对菌株造成一定的毒性，从而抑制菌株的生长和生产。常用的手段是在发酵时加入中和添加剂以使发酵环境保持中性。目前固体碳酸镁被认为是最有利于丁二酸发酵的中和添加剂，其会与发酵产物反应形成丁二酸盐，而丁二酸碱式盐后续复杂繁冗的分离纯化过程一直是阻碍其大规模生产的难题。因此，如何实现在少添加或不添加中和剂的情况下进行发酵对丁二酸的生产具有重要意义。
3、目前实现在少添加或不添加中和剂的情况下进行发酵生产丁二酸的主要策略是开发能够进行低ph下发酵生产丁二酸的菌株，如cn116656514a公开了一种耐酸酵母及其应用，其可以在较低ph下发酵生产丁二酸。
4、综上所述，开发新型的能够进行低ph下发酵生产丁二酸的菌株，扩展丁二
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种耐酸库德里亚兹毕赤酵母及其应用，筛选获得耐低ph库德里亚兹毕赤酵母，并进一步开发工程菌，以期实现高效生产丁二酸等有机酸。
2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种耐酸库德里亚兹毕赤酵母，所述耐酸库德里亚兹毕赤酵母为pichia kudriavzevii s9，于2024年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc.no：65148。
4、本专利技术中，从葡萄表皮微生物中筛选得到一株新的库德里亚兹毕赤酵母(pichiakudriavzevii)，命名为pichia kudriavzevii s9，其能耐受低ph环境(ph1.8)，在发酵过程中，无需添加ph中和剂，在酸性条件下即可生长并高效生产酸性物质，有利于在不影响生产菌的基础上实现产物的高浓度积累，为有机酸(如丁二酸)的生产提供新菌株。
5、第二方面，本专利技术提供第一方面所述的耐酸库德里亚兹毕赤酵母在生产酸性物质中的应用。
6、第三方面，本专利技术提供一种发酵生产酸性物质的方法，所述方法包括：
7、利用第一方面所述的耐酸库德里亚兹毕赤酵母进行发酵生产。
8、可以理解，本领域通用的产酸菌株发酵方法以及产物纯化方法均适用于本专利技术。
9、优选地，所述酸性物质包括有机酸。
10、优选地，所述有机酸包括丁二酸、乳酸或苹果酸中至少一种。
11、第四方面，本专利技术提供一种工程菌，所述工程菌的出发菌株为第一方面所述的耐酸库德里亚兹毕赤酵母，所述工程菌经过以下任意一种遗传改造：
12、(1)缺失甘油代谢基因；
13、(2)缺失甘油代谢基因和乙醇代谢基因；
14、(3)缺失甘油代谢基因、乙醇代谢基因和丁二酸降解基因；
15、(4)缺失甘油代谢基因、乙醇代谢基因和丁二酸降解基因，过表达丁二酸转运基因。
16、本专利技术中，基于筛选的耐酸库德里亚兹毕赤酵母进行遗传改造，包括敲除丁二酸降解相关基因，敲除乙醇和甘油生产途径以及增强丁二酸转运蛋白表达，获得高产丁二酸的工程菌。
17、优选地，所述丁二酸降解基因包括sdh5基因、sdh2基因、sdh3基因或sdh4基因中至少一种。
18、优选地，所述甘油代谢基因包括gpd基因。
19、优选地，所述乙醇代谢基因包括pdc基因和/或adh1基因。
20、优选地，所述丁二酸转运基因包括spmae1基因。
21、本专利技术中设计了提高丁二酸产量的遗传改造策略，可以理解，本领域通用的敲除基因或降低基因表达的策略均可应用于本专利技术，对菌株进行改造。
22、第五方面，本专利技术提供第四方面所述工程菌的构建方法，所述工程菌的构建方法包括：
23、以第一方面所述的耐酸库德里亚兹毕赤酵母为出发菌株，敲除其中丁二酸降解基因、甘油代谢基因和乙醇代谢基因，并过表达丁二酸转运基因，得到所述工程菌。
24、第六方面，本专利技术提供第四方面所述的工程菌在生产酸性物质中的应用。
25、第七方面，本专利技术提供一种发酵生产酸性物质的方法，所述方法包括：
26、利用第四方面所述的工程菌进行发酵生产。
27、优选地，所述酸性物质包括有机酸。
28、优选地，所述有机酸包括丁二酸、乳酸或苹果酸中至少一种。
29、本专利技术基于筛选的耐酸库德里亚兹毕赤酵母进行遗传改造，获得高产丁二酸的工程菌，在不添加中和剂的情况下丁二酸发酵产量达到31.74g/l。
30、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
31、本专利技术从葡萄表面微生物中筛选出一株耐低ph的库德里亚兹毕赤酵母，其能够耐受ph 1.8的环境，在不添加中和剂的条件下发酵有机酸；此外，基于库德里亚兹毕赤酵母进行遗传改造，包括敲除丁二酸降解相关基因，敲除乙醇和甘油生产途径以及增强丁二酸转运蛋白表达，获得高产丁二酸的工程菌，在不添加中和剂的情况下丁二酸发酵产量达到31.74g/l。
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1.一种耐酸库德里亚兹毕赤酵母，其特征在于，所述耐酸库德里亚兹毕赤酵母为Pichia kudriavzevii S9，于2024年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC.No：65148。
2.权利要求1所述的耐酸库德里亚兹毕赤酵母在生产酸性物质中的应用。
3.一种发酵生产酸性物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
4.根据权利要求3所述的发酵生产酸性物质的方法，其特征在于，所述酸性物质包括有机酸；
5.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株为权利要求1所述的耐酸库德里亚兹毕赤酵母，所述工程菌经过以下任意一种遗传改造：
6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述丁二酸降解基因包括SDH5基因、SDH2基因、SDH3基因或SDH4基因中至少一种；
7.权利要求5或6所述的工程菌的构建方法，其特征在于，所述工程菌的构建方法包括：
8.权利要求5或6所述的工程菌在生产酸性物质中的应用。
9.一种发酵生产酸性物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
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