【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于猪病原检测产品，具体涉及一组同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的引物探针组、检测方法及应用。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，prrsv)是猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome，prrs)的病原，国际病毒分类委员会(ictv)将prrsv分为欧洲型(prrsv-1)和美洲型(prrsv-2)。猪繁殖与呼吸综合征(prrs)是猪场普遍存在的一种传染病，表现为母猪的繁殖失败和仔猪、生长猪的呼吸道疾病。
2、猪繁殖与呼吸综合征，自从上世纪80年代美国首次报导该病以来，prrsv的流行特征在不断变化。精确诊断是有效防控prrs的前提，由于不同基因型的prrsv一直在各个养猪场传播，且prrsv-1和prrsv-2的核苷酸同源性很低(50～70％)，加之prrsv不断出现新的突变、缺失、插入及重组，使prrsv成为变异率较高的病毒之一，目前的检测方法均不能覆盖所有类型的prrsv，存在漏检和误诊的风险。此外prrsv感染猪只后，会侵害机体的免疫器官，使感染猪只免疫力下降，容易继发其他病毒及细菌感染，使本就难于防治的疫病更加复杂。建立一种能够快速检测包含各种不同类型的prrsv的方法对于该病的防控显得尤为重要。
3、目前，国内外已经报道的prrsv检测方法较多。病毒分离鉴定是检测prrs病原的金标方法，但该方法技术要
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一组同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的引物探针组、检测方法及应用。本专利技术所述引物探针组能够实现猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的高效检测，检测简便、灵敏度高、特异性好、速度快、假阳性低且可高通量检测。
2、本专利技术提供了一组同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的引物探针组，包括通用正向引物prrsv1-f和prrsv2-f，反向引物prrsv1-r和prrsv2-r，通用探针prrsv-p；
3、所述prrsv1-f的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述prrsv2-f的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述prrsv1-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述prrsv2-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；
4、所述prrsv-p的核苷酸序列如seq id no.5所示。
5、优选的是，所述探针prrsv-p的核苷酸序列的5’端采用荧光报告基团修饰，包括fam；3’端采用荧光淬灭基团修饰，包括bhq1。
6、本专利技术还提供了上述技术方案所述的引物探针组在制备同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的产品中的应用。
7、优选的是，所述产品包括试剂盒。
8、本专利技术还提供了一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组和反应液。
9、优选的是，所述反应液包括2×one step u+mix和one step u+enzyme mix。
10、本专利技术还提供了一种非诊断目的的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的方法，包括以下步骤：
11、使用上述技术方案所述的引物探针组或上述技术方案所述的试剂盒对待测样本进行荧光pcr检测，当ct值小于38时判定为阳性，ct值大于等于38时判定为阴性。
12、优选的是，以待测样本的rna为模板，每20μl所述荧光pcr检测的反应体系包括：2×one step u+mix 10.0μl，one step u+enzyme mix 1.0μl，10μmol/l的prrsv1-f、10μmol/l的prrsv2-f、10μmol/l的prrsv1-r和10μmol/l的prrsv2-r各0.4μl～1.0μl，10μmol/l的prrsv-p 0.3μl～0.5μl，3μl rna和余量的水。
13、优选的是，所述荧光pcr检测的反应程序为：逆转录55℃15min，预变性95℃10sec，循环反应95℃10sec，60℃30sec，45个循环。
14、本专利技术提供了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的引物探针组。本专利技术根据猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组3'非编码区(3'utr)序列设计一组特异性引物及探针，本专利技术提供的通用的引物探针组能够特异性识别猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株所有基因型，引物探针组合在扩增过程中互相不影响，对靶基因可以准确定量、定性检测，简便、快速、高效且灵敏度高。试验结果表明，使用本专利技术引物探针组进行检测，最低检测限达3.27copies/μl，灵敏度高；与猪瘟病毒(csfv c株)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪伪狂犬病毒(prvbartha-k61株)、猪细小病毒(ppv 7909株)、猪流行性腹泻病毒(pedv弱毒cv777株)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev弱毒华毒株)、猪轮状病毒(rv g5型na株)、猪德尔塔冠状病毒(pdcov)无交叉反应，特异性好；标准曲线扩增效率高，能实现猪繁殖与呼吸综合征病毒的定量检测；进行荧光pcr检测时，批内和批间试验的变异系数(cv％)处于0.21％～1.74％之间，具有很好的稳定性。
15、本专利技术利用所述引物探针组建立的非诊断目的的荧光定量pcr检测方法，具有简便、快速、高效、特异性强、高灵敏性的特点，可广泛应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测、发病猪场环境中的病原学检测和相关科学研究，具有很高的实际应用价值。
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1.一组同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的引物探针组，其特征在于，包括通用正向引物PRRSV1-F和PRRSV2-F，反向引物PRRSV1-R和PRRSV2-R，通用探针PRRSV-P；
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针PRRSV-P的核苷酸序列的5’端采用荧光报告基团修饰，包括FAM；3’端采用荧光淬灭基团修饰，包括BHQ1。
3.权利要求1或2所述的引物探针组在制备同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
5.一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组和反应液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括2×One Step U+Mix和One Step U+Enzyme Mix。
7.一种非诊断目的的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR检测的反应程序为：逆转录55℃15min，预变性95℃10sec，循环反应95℃10sec，60℃30sec，45个循环。
...【技术特征摘要】
1.一组同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的引物探针组，其特征在于，包括通用正向引物prrsv1-f和prrsv2-f，反向引物prrsv1-r和prrsv2-r，通用探针prrsv-p；
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针prrsv-p的核苷酸序列的5’端采用荧光报告基团修饰，包括fam；3’端采用荧光淬灭基团修饰，包括bhq1。
3.权利要求1或2所述的引物探针组在制备同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
5.一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和欧洲株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组和反应液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括2×one step u+mix和one st...
【专利技术属性】
技术研发人员：王利丽，鄢明华，董志民，田向学，朱琪，李富强，任卫科，张莉，郭笑然，江珊，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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