【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因表达调控的，具体地涉及一种 pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用。
技术介绍
1、卵巢颗粒细胞是卵泡的主要成分，其功能与卵泡发育正常与否息息相关，其中，卵巢颗粒细胞的细胞周期是影响卵巢颗粒细胞功能的主要因素之一。
2、细胞周期进程主要受细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases, cdks）等调控。细胞周期蛋白e1（cyclin e1, ccne1）是参与调节细胞周期的关键基因，ccne1与细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase2, cdk2）形成复合物，促进细胞g1/s期进程。在人骨肉瘤细胞中过表达ccne1，显著促进细胞进入s期，导致双链dna断裂。此外，ccne1也能够激活cdk1，促进细胞向m期过度。 已有研究表明，目前研究的能够参与调控细胞周期的关键基因包括cdk1、cdk2、cdk4、ccnd1、ccnb1、ccnb2、ccne1、ccne2等，如果能发现一种新的调控机制，使其从上游对多种周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶产生影响，进而影响细胞周期，这将使细胞周期的调控更为简单高效。
3、血小板活化因子乙酰水解酶1b调节亚基1（platelet activating factoracetylhydrolase 1b regulatory subunit 1, pafah1b1）是血小板活化因子（paf）的调节亚基，paf作为脂质
技术实现思路
1、为了更为简单、高效地调控颗粒细胞周期进而调控颗粒细胞功能和卵泡发育，本申请的目的在于提供一种 pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用。
2、为了实现本申请的目的，本申请提供的一种 pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，采用如下的技术方案：
3、调控所述卵巢颗粒细胞中 pafah1b1基因表达调控所述卵巢颗粒细胞周期，包括增加 pafah1b1基因表达量或活性的步骤；或者包括减少 pafah1b1基因表达量或活性的步骤；或者包括在受体细胞中促进或抑制 pafah1b1基因表达产物与细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的结合的步骤。进一步地，以 pafah1b1基因序列为目的片段，设计并合成 pafah1b1基因过表达载体引物f和引物r，以cov434为模板扩增所述目的片段，构建 pafah1b1过表达载体；
4、所述引物f的序列如seq id no: 21所示，所述引物r的序列如seq id no:22所示；体外环境下，将所述 pafah1b1过表达载体导入受体细胞，使 pafah1b1基因在所述受体细胞内表达。
5、更为具体地，是以 pafah1b1基因cds区序列为目的片段，设计并合成 pafah1b1基因过表达载体引物。
6、进一步地，设计并合成sirna干扰片段，体外环境下，将所述sirna干扰片段导入受体细胞，干扰受体细胞内 pafah1b1的表达；所述sirna干扰片段为pafah1b1-sirna1，所述pafah1b1-sirna1的序列如seq id no: 23所示。
7、进一步地，所述sirna干扰片段为pafah1b1-sirna2，所述pafah1b1-sirna2的序列如seq id no: 24所示。
8、进一步地，所述sirna干扰片段为pafah1b1-sirna3，所述pafah1b1-sirna3的序列如seq id no: 25所示，
9、更为具体地，后续选择100 nm浓度的pafah1b1-sirna3开展后续研究，命名为nd-pafah1b1。
10、进一步地，体外环境下，构建 pafah1b1过表达载体，转染所述 pafah1b1过表达载体至颗粒细胞，降低颗粒细胞g1期细胞的比例，升高g2/m期细胞的比例。
11、实验结果表明，转染所述 pafah1b1过表达载体至颗粒细胞，能够促进 pafah1b1表达，显著降低颗粒细胞g1期细胞的比例，升高g2/m期细胞的比例。
12、进一步地，利用所述sirna 干扰片段转染颗粒细胞，减少 pafah1b1表达，升高颗粒细胞g1期细胞的比例，降低g2/m期细胞的比例。
13、实验结果表明，利用所述sirna干扰片段转染颗粒细胞，减少 pafah1b1表达，能够显著升高颗粒细胞g1期细胞的比例，降低g2/m期细胞的比例。
14、进一步地，过表达 pafah1b1，能够促进cdk1、cdk2、cdk4、ccnd1、ccne1和ccne2的表达，抑制ccnb1和ccnb2的mrna 水平，影响颗粒细胞的细胞周期；干扰 pafah1b1基因，能够抑制cdk1、cdk2、cdk4、ccnd1、ccne1和ccne2的表达，促进ccnb1和ccnb2的表达，影响颗粒细胞的细胞周期。
15、实验结果表明，过表达 pafah1b1基因，显著促进cdk1、cdk2、cdk4、ccnd1、ccne1和ccne2的mrna水平，显著抑制ccnb1和ccnb2的mrna水平。干扰 pafah1b1基因，显著抑制cdk1、cdk2、cdk4、ccnd1和ccne1的mrna水平，抑制ccne2的mrna水平，差异不显著，显著促进ccnb1和ccnb2的mrna水平。过表达 pafah1b1基因，显著促进cdk1、cdk2、cdk4、ccnd1、ccne1和ccne2的蛋白表达水平，对ccnb1和ccnb2的蛋白表达水平影本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，调控所述卵巢颗粒细胞中PAFAH1B1基因表达调控所述卵巢颗粒细胞周期，包括增加PAFAH1B1基因表达量或活性的步骤；或者包括减少PAFAH1B1基因表达量或活性的步骤；或者包括在受体细胞中促进或抑制PAFAH1B1基因表达产物与细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶结合的步骤。
2.根据权利要求1所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，以PAFAH1B1基因序列为目的片段，设计并合成PAFAH1B1基因过表达载体引物F和引物R，以COV434为模板扩增所述目的片段，构建PAFAH1B1过表达载体；所述引物F的序列如SEQ IDNO: 21所示，所述引物R的序列如SEQ ID NO: 22所示；体外环境下，将所述PAFAH1B1过表达载体导入受体细胞，使PAFAH1B1基因在所述受体细胞内表达。
3.根据权利要求1所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，设计并合成siRNA干扰片段，体外环境下，将所述siRNA干扰片段导入受体细胞
4.根据权利要求3所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，所述siRNA 干扰片段为PAFAH1B1-siRNA2，所述PAFAH1B1-siRNA2的序列如SEQ ID NO:24所示。
5.根据权利要求3所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，所述siRNA干扰片段为PAFAH1B1-siRNA3，所述PAFAH1B1-siRNA3的序列如SEQ ID NO:25所示。
6.根据权利要求1-2任一项所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于：体外环境下，构建PAFAH1B1过表达载体，转染所述PAFAH1B1过表达载体至颗粒细胞，降低颗粒细胞G1期细胞的比例，升高G2/M期细胞的比例。
7.根据权利要求1或3-5任一项所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于：利用所述siRNA 干扰片段转染颗粒细胞，减少PAFAH1B1表达，升高颗粒细胞G1期细胞的比例，降低G2/M期细胞的比例。
8.根据权利要求1-5任一项所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于：过表达PAFAH1B1，能够促进CDK1、CDK2、CDK4、CCND1、CCNE1和CCNE2的表达，抑制CCNB1和CCNB2的mRNA水平，影响颗粒细胞的细胞周期；干扰PAFAH1B1基因，能够抑制CDK1、CDK2、CDK4、CCND1、CCNE1和CCNE2的表达，促进CCNB1和CCNB2的表达，影响颗粒细胞的细胞周期。
9.根据权利要求8所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于：影响PAFAH1B1在mRNA水平与CDK1、CDK2、CCNB1、CCNB2、CCNE1中的任意一个结合影响细胞周期。
10.根据权利要求8所述的一种PAFAH1B1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于：影响PAFAH1B1在蛋白水平与CDK1、CDK2、CDK4、CCND1、CCNB2、CCNE1、CCNE2中的任意一个或者几个的复合物的结合影响细胞周期。
...【技术特征摘要】
1.一种pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，调控所述卵巢颗粒细胞中pafah1b1基因表达调控所述卵巢颗粒细胞周期，包括增加pafah1b1基因表达量或活性的步骤；或者包括减少pafah1b1基因表达量或活性的步骤；或者包括在受体细胞中促进或抑制pafah1b1基因表达产物与细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶结合的步骤。
2.根据权利要求1所述的一种pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，以pafah1b1基因序列为目的片段，设计并合成pafah1b1基因过表达载体引物f和引物r，以cov434为模板扩增所述目的片段，构建pafah1b1过表达载体；所述引物f的序列如seq idno: 21所示，所述引物r的序列如seq id no: 22所示；体外环境下，将所述pafah1b1过表达载体导入受体细胞，使pafah1b1基因在所述受体细胞内表达。
3.根据权利要求1所述的一种pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，设计并合成sirna干扰片段，体外环境下，将所述sirna干扰片段导入受体细胞，干扰受体细胞内pafah1b1的表达；所述sirna干扰片段为pafah1b1-sirna1，所述pafah1b1-sirna1的序列如seq id no: 23所示。
4.根据权利要求3所述的一种pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，所述sirna 干扰片段为pafah1b1-sirna2，所述pafah1b1-sirna2的序列如seq id no:24所示。
5.根据权利要求3所述的一种pafah1b1基因在卵巢颗粒细胞周期中的应用，其特征在于，所述sirna干扰片段为pa...
【专利技术属性】
技术研发人员：何颖婷，袁晓龙，李加琪，张哲，高亚辉，周尹祺，李念，李硕，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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