【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种靶向心内神经元的m-slc18a2基因过表达载体及其构建方法。
技术介绍
1、m-slc18a2基因在体内表达为2型囊泡单胺转运酶vmat2，在神经元中负责单胺类神经递质的转运、储存和释放，对维持心内神经系统的正常功能至关重要。
2、腺相关病毒(aav)作为一种基因治疗载体，具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广等优势，已广泛应用于基因治疗领域。
3、loxp位点是一种34个碱基对的回文序列，由两个13个碱基的反向重复序列和一个8个碱基的间隔序列组成。这个间隔序列决定了loxp位点的方向。loxp位点最初在p1噬菌体中被发现，并被cre重组酶特异性识别。
4、在cre-loxp重组系统中，loxp位点起到标记和定位的作用，通常位于需要进行基因操作的dna序列两侧。当cre重组酶存在时，它会识别并结合到loxp位点上，介导两个loxp位点之间的dna序列发生重组，实现基因的敲除、插入、翻转或易位等操作。一般而言，有以下几种可能：(1)如果两个loxp位点位于一条dna链上，但方向相反，cre重组酶能导致两个loxp位点间的序列翻转；(2)如果两个loxp位点位于一条dna链上，并且方向相同，cre重组酶能有效切除两个loxp位点间的序列；(3)如果两个loxp位点分别位于两条不同的dna链或染色体上，cre酶能介导两条dna链的交换或染色体易位；(4)如果四个loxp位点分别位于两条不同的dna链或染色体上，cre重组酶可能诱导loxp间的序列互换。
>技术实现思路
1、为解决上述技术问题，一方面，本专利技术通过构建m-slc18a2基因过表达载体，并将其导入体内，可有效提高m-slc18a2基因的表达水平，从而改善神经递质的合成和释放，为心内神经元可塑性的研究提供了新的策略。另一方面，本专利技术可通过cre小鼠体内导入m-slc18a2基因重组过表达载体，aav2/9-php.s血清型腺相关病毒特异性导向心内神经元细胞，cre小鼠体内的cre重组酶将所述m-slc18a2基因过表达载体中两个lox-p位点之间的dna序列发生翻转，实现m-slc18a2基因在心内神经元(尤其是chat神经元)细胞中的特异性表达。
2、第一方面，本专利技术提供一种m-slc18a2基因过表达载体。
3、一种m-slc18a2基因过表达载体，其包括：可操作性地连接有以下序列元件的载体：启动子序列、倒置的zsgreen序列、倒置的m-slc18a2基因序列和dio元件序列。
4、在一些实施例中，所述dio元件序列为两条序列片段(dio元件序列-1和dio元件序列-2)；所述zsgreen序列和m-slc18a2基因序列可操作地连接在所述dio元件序列的两条序列之间。
5、在一些实施例中，所述dio元件序列的两个序列片段中各一个loxp位点，两个loxp位点的方向相反。
6、在一些实施例中，所述启动子序列为h-syn启动子序列。
7、在一些实施例中，所述h-syn启动子序列包含seq id no.4的序列或与seq idno.4具有至少80％同一性的功能性变体。
8、在一些实施例中，所述倒置的zsgreen序列包含seq id no.5的序列或与seqidno.5具有至少80％同一性的功能性变体。在一些实施例中，所述倒置的zsgreen序列包含seq id no.5的序列或与seq id no.5具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的功能性变体。
9、在一些实施例中，所述倒置的m-slc18a2基因序列包含seq id no.6的序列或与seqid no.6具有至少80％同一性的功能性变体。在一些实施例中，所述倒置的m-slc18a2基因序列包含seq id no.6的序列或与seq id no.6具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的功能性变体。
10、在一些实施例中，所述dio元件序列包括：(1)seq id no.7的序列或与seq idno.7具有至少80％同一性的功能性变体，和(2)seq id no.8的序列或与seq id no.8具有至少80％同一性的功能性变体。
11、在一些实施例中，所述dio元件序列包括：(1)seq id no.7的序列或与seq idno.7具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的功能性变体，和(2)seq id no.8的序列或与seq id no.8具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的功能性变体。
12、在一些实施例中，所述dio元件序列包括：(1)seq id no.7的序列或与seq idno.7具有至少90％同一性的功能性变体，和(2)seq id no.8的序列或与seq id no.8具有至少90％同一性的功能性变体。
13、在一些实施例中，所述dio元件序列包括：(1)seq id no.7的序列或与seq idno.7具有至少95％同一性的功能性变体，和(2)seq id no.8的序列或与seq id no.8具有至少95％同一性的功能性变体。
14、在一些实施例中，所述dio元件序列包括：(1)seq id no.7的序列或与seq idno.7具有至少98％同一性的功能性变体，和(2)seq id no.8的序列或与seq id no.8具有至少98％同一性的功能性变体。
15、在一些实施例中，所述dio元件序列包括：(1)seq id no.7的序列或与seq idno.7具有至少99％同一性的功能性变体，和(2)seq id no.8的序列或与seq id no.8具有至少99％同一性的功能性变体。
16、在一些实施例中，所述m-slc18a2基因过表达载体还包括终止子序列。
17、在一些实施例中，所述m-slc18a2基因过表达载体中所述终止子序列为seq idno.11的序列或与seq id no.11具有至少80％同一性的功能性变体。在一些实施例中，所述m-slc18a2基因过表达载体中所述终止子序列为seq id no.11的序列或与seq id no.11具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的功能性变体。
18、在一些实施例中，所述m-slc18a2基因过表达载体中所述终止子序列可操作地连接所述倒置的m-slc18a2基因序列。
19、在一些实施例中，所述载体为腺相关病毒。
20、在一些实施例中，所述腺相关病毒为血清型为aav2/9-php.s的腺相关病毒。
21、在一些实施例中，所述m-slc18本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种m-Slc18a2基因过表达载体，其特征在于，包括：可操作性地连接有以下序列元件的载体：启动子序列、倒置的ZsGreen序列、倒置的m-Slc18a2基因序列和DIO元件序列。
2.根据权利要求1所述的m-Slc18a2基因过表达载体，所述DIO元件序列为两条序列片段；所述ZsGreen序列和m-Slc18a2基因序列可操作地连接在所述DIO元件序列的两条序列之间；和/或
3.根据权利要求1-2任一项所述的m-Slc18a2基因过表达载体，所述m-Slc18a2基因过表达载体的序列为包含SEQ ID NO.1的序列或与SEQ ID NO.1具有至少80％同一性的功能性变体。
4.一种表达盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的m-Slc18a2基因过表达载体中的启动子序列、倒置的ZsGreen序列、倒置的m-Slc18a2基因序列和DIO元件序列；
5.一种在Chat神经元细胞表达基因的体外方法，其特征在于，包括用权利要求1-3任一项所述m-Slc18a2基因过表达载体或权利要求4所述表达盒转染细胞系或细胞群，其中所述
6.一种分离的细胞，其特征在于，所述分离的细胞包含权利要求1-3任一项所述m-Slc18a2基因过表达载体或权利要求4所述表达盒；
7.一种试剂，其特征在于，所述试剂包含权利要求1-3任一项所述m-Slc18a2基因过表达载体或权利要求4所述表达盒。
8.一种权利要求1-3任一项所述m-Slc18a2基因过表达载体、权利要求4所述表达盒、权利要求6所述细胞或权利要求7所述试剂在构建过表达m-Slc18a2基因的动物模型中的用途。
9.一种引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
10.一种权利要求1-3任一项所述m-Slc18a2基因过表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种m-slc18a2基因过表达载体，其特征在于，包括：可操作性地连接有以下序列元件的载体：启动子序列、倒置的zsgreen序列、倒置的m-slc18a2基因序列和dio元件序列。
2.根据权利要求1所述的m-slc18a2基因过表达载体，所述dio元件序列为两条序列片段；所述zsgreen序列和m-slc18a2基因序列可操作地连接在所述dio元件序列的两条序列之间；和/或
3.根据权利要求1-2任一项所述的m-slc18a2基因过表达载体，所述m-slc18a2基因过表达载体的序列为包含seq id no.1的序列或与seq id no.1具有至少80％同一性的功能性变体。
4.一种表达盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的m-slc18a2基因过表达载体中的启动子序列、倒置的zsgreen序列、倒置的m-slc18a2基因序列和dio元件序列；
5.一种在chat神经元细胞表达基因的体...
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