【技术实现步骤摘要】
本公开内容涉及使用短发夹rna、核酶和/或微rna来激活人类快乐木偶综合征(angelman syndrome)神经元中的ube3a的父系遗传等位基因表达的组合物和方法。
技术介绍
0、专利技术背景
1、快乐木偶综合征(as)是一种影响～1/15,000名个体的神经发育病症。患有as的个体有发育迟缓、严重的认知损害、共济失调步态、频繁癫痫发作(frequent seizures)、短注意力时长(short attention span)、言语缺失(absent speech)和特征性快乐举止(characteristic happy demeanor)。从来自as患者的诱导多能干细胞(ipsc)衍生的神经元表现出去极化的静息膜电位、延迟的动作电位发展和自发突触活动减少。as影响相对大的患者群体；已经建立了一个>3,000名患者的联系登记，并且每年有～250例新的as诊断。患有as的个体需要终身护理。
2、as由ube3a的母系拷贝功能丧失引起，ube3a是一种编码e3泛素连接酶的基因。这种功能丧失突变可以由母系等位基因中的任何类型的基因突变引起。ube3a排他地由神经元中的母系等位基因表达。所有患有as的个体都有正常的父系ube3a等位基因，该等位基因被一种称为ube3a反义转录物(ube3a-ats)的长的非编码rna进行表观遗传学上的沉默。在as小鼠模型中，父系等位基因的再激活显示出恢复ube3a蛋白表达并减轻行为缺陷。人类中ube3a表达的恢复有望改善疾病，特别是如果在婴儿中恢复有望改善疾病。
3、不存在用于快乐木偶综合征的治愈方法(cure)，然而，制药公司和学术实验室正在寻求两种方法来治愈这种病症。第一种是利用反义寡核苷酸(aso)切割ube3a-ats并激活父系ube3a。第二种方法是aav介导的基因疗法，以将ube3a基因导回至患者。上文提及的aso不能跨越血脑屏障，并且需要终生反复注射到脊髓中。将ube3a基因导回神经元的基因疗法缺乏调节ube3a mrna和蛋白质水平的能力，并且需要从总计三种蛋白质同种型中选择单种蛋白质同种型，其中个体同种型的功能仍然不确定。这可能导致ube3a的过表达，这也可能导致另一种相关的病症dup15q综合征，以及导致重要的蛋白质同种型不存在。
4、专利技术简要概述
5、本专利技术提供了一种通过基因疗法治疗as的新方法，该方法通过抑制父系ube3a的沉默并使父系ube3a从其天然调节元件表达。神经元中的ube3a表达增加可以改善ube3a-ats对上文列出的神经元的影响。所有三种蛋白质同种型可以使用通常控制其水平的内源性调节元件来表达。因此，由于使用了天然调节元件，防止了过表达。这种方法可以通过单一治疗改善as症状，并从而避免aso所需的反复脊髓注射。
6、在一方面，本专利技术提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码短发夹rna(shrna)、核酶或微rna的第一核苷酸序列，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
7、在另一方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸和启动子，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
8、在另一方面，本专利技术提供了一种病毒颗粒，所述病毒颗粒包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
9、在另一方面，本专利技术提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸或包含该多核苷酸的病毒颗粒以及药学上可接受的载体，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
10、在另一方面，本专利技术提供了一种治疗快乐木偶综合征的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的病毒颗粒或其药物组合物，该病毒颗粒包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
11、在另一方面，本专利技术提供了一种激活或增加父系ube3a基因表达的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的病毒颗粒或其药物组合物，该病毒颗粒包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
12、在另一方面，本专利技术提供了一种抑制由seq id no:1编码的rna反义转录物引起的父系ube3a基因沉默的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的病毒颗粒或其药物组合物，该病毒颗粒包含具有编码短发夹rna(shrna)、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
13、在另一方面，本专利技术提供了由本文描述的多核苷酸编码并能够抑制父系ube3a沉默的shrna、核酶或微rna。
14、本专利技术还提供了以下项目：
15、1.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码短发夹rna(shrna)、核酶或微rna的第一核苷酸序列，其中所述shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。
16、2.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列编码所述shrna。
17、3.根据项目2所述的多核苷酸，其中所述shrna包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列与由seq id no:5或seq id no:9-508中的任一种编码的rna至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
18、4.根据项目2或3所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列是seq id no:2。
19、5.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列编码所述核酶。
20、6.根据项目5所述的多核苷酸，其中所述核酶包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列与由seq id no:6或seq id no:7中的任一种编码的rna至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
21、7.根据项目5所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列是seq id no:3或seq idno:4。
22、8.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列编码所述微rna。
23、9.根据项目8所述的多核苷酸，其中所述微rna包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列与由seq id no:5或seq id no:9-508中的任一种编码的rna至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
24、10.根据项目8或9所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列是seq id no:8。
25、11.根据项目1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述shrna、核酶或微rna增加父系ube3a的表达。
26、12.根据项目1-11中任一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码核酶的核苷酸序列，其中所述核酶能够抑制父系UBE3A基因的沉默，并且其中所述编码核酶的核苷酸序列由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4组成。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酶增加父系UBE3A基因的表达。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述父系UBE3A基因包括SEQ ID NO:509的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述父系UBE3A基因的沉默是由SEQ ID NO:1编码的RNA转录物引起的。
5.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸和启动子。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述启动子是U6启动子。
7.根据权利要求5或6所述的表达载体，其中所述多核苷酸是DNA多核苷酸。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。
9.一种病毒颗粒，所述病毒颗粒包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的病毒颗粒，其中所述颗粒是AAV颗粒或慢病毒颗粒。
11.根据权利要求10所述的病毒颗粒，其中所述颗粒是具有专性嗜神经性的AAV颗粒。
12.根据权利要求10所述的病毒颗粒，其中所述颗粒是AAV9颗粒或AAV10颗粒。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求5-8中任一项所述的表达载体或根据权利要求9-12中任一项所述的病毒颗粒以及药学上可接受的载体。
14.权利要求5-8中任一项所述的表达载体、权利要求9-12中任一项所述的病毒颗粒或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗快乐木偶综合征的药物中的用途，其中当所述药物被使用时，治疗有效量的所述表达载体、所述病毒颗粒或所述药物组合物被施用至有相应需要的患者。
15.权利要求5-8中任一项所述的表达载体、权利要求9-12中任一项所述的病毒颗粒或权利要求13所述的药物组合物在制备用于激活或增加父系UBE3A基因表达的药物中的用途，其中当所述药物被使用时，治疗有效量的所述表达载体、所述病毒颗粒或所述药物组合物被施用至有相应需要的患者。
16.权利要求5-8中任一项所述的表达载体、权利要求9-12中任一项所述的病毒颗粒或权利要求13所述的药物组合物在制备用于抑制由SEQ ID NO:1编码的RNA反义转录物引起的父系UBE3A基因沉默的药物中的用途，其中当所述药物被使用时，有效切割所述由SEQ IDNO:1编码的RNA反义转录物的量的所述表达载体、所述病毒颗粒或所述药物组合物被施用至有相应需要的患者。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的用途，其中所述表达载体、所述病毒颗粒或所述药物组合物被施用至所述患者的脑。
18.根据权利要求14-16中任一项所述的用途，其中所述表达载体、所述病毒颗粒或所述药物组合物被施用至所述患者的神经元。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的用途，其中所述患者为人类。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的用途，其中所述核酶抑制所述由SEQ ID NO:1编码的RNA反义转录物引起的父系UBE3A基因的沉默。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的用途，其中所述核酶终止包含SEQ ID NO:1的序列的多核苷酸的转录。
22.根据权利要求14-21中任一项所述的用途，其中所述核酶降低所述由SEQ ID NO:1编码的RNA反义转录物的水平。
23.根据权利要求14-22中任一项所述的用途，其中所述核酶切割所述由SEQ ID NO:1编码的RNA反义转录物。
24.一种核酶，所述核酶由根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸编码。
...【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码核酶的核苷酸序列，其中所述核酶能够抑制父系ube3a基因的沉默，并且其中所述编码核酶的核苷酸序列由seq id no:3或seq id no:4组成。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酶增加父系ube3a基因的表达。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述父系ube3a基因包括seq id no:509的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述父系ube3a基因的沉默是由seq id no:1编码的rna转录物引起的。
5.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸和启动子。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述启动子是u6启动子。
7.根据权利要求5或6所述的表达载体，其中所述多核苷酸是dna多核苷酸。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是腺相关病毒(aav)载体或慢病毒载体。
9.一种病毒颗粒，所述病毒颗粒包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的病毒颗粒，其中所述颗粒是aav颗粒或慢病毒颗粒。
11.根据权利要求10所述的病毒颗粒，其中所述颗粒是具有专性嗜神经性的aav颗粒。
12.根据权利要求10所述的病毒颗粒，其中所述颗粒是aav9颗粒或aav10颗粒。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求5-8中任一项所述的表达载体或根据权利要求9-12中任一项所述的病毒颗粒以及药学上可接受的载体。
14.权利要求5-8中任一项所述的表达载体、权利要求9-12中任一项所述的病毒颗粒或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗快乐木偶综合征的药物中的用途，其中当所述药物被使用时，治疗有效量的所述表达载体、所述病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯托米·张伯伦，诺艾儿·杰曼，
申请(专利权)人：康涅狄格大学，
类型：发明
国别省市：
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