【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及硝基还原酶突变体、制备方法及应用。更具体地，涉及硝基还原酶突变体及其制备方法、核酸分子、表达载体、重组细胞、重组菌株、制备硝基还原产物的方法、试剂盒及其用途。
技术介绍
1、硝基还原酶是一类依赖于fmn或fad的细胞质酶，可利用nad(p)h实现硝基芳香族化合物和硝基杂环衍生物的还原代谢。硝基还原酶具有广泛的应用领域，包括药物激活、羟氨合成、污染物生物代谢等。但目前硝基还原酶的催化效率较低，严重限制了其在临床应用中的广泛应用。
2、因此，本领域亟需开发一种催化活性更高的硝基还原酶。
技术实现思路
1、本申请是专利技术人基于下列发现完成的：
2、1)现有硝基还原酶催化活力较低。
3、2)将高催化活性的硝基还原酶应用于硝基还原反应中可以提高产率，节省试剂用量，对环境污染较小。
4、为此，本专利技术的一个目的在于提供一种高催化活性的硝基还原酶突变体。
5、本申请旨在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
6、在本申请的第一方面，本申请提出了一种硝基还原酶突变体。根据本申请的实施例，包括：与野生型硝基还原酶相比，具有以下四个位点或功能等同位点中具有至少一个氨基酸突变：第15位、第69位、第172位、第173位。
7、根据本申请的实施例，专利技术人利用易错pcr技术和定点突变技术对野生型硝基还原酶bantr进行分子改造，进而获得的催化活力提高的硝基还原酶bantr突变
8、需要说明的是，所述同等功能位点是指一种硝基还原酶中相同功能结构域所对应的氨基酸位点。示例性地，某种硝基还原酶具有两个相同功能的功能结构域a和b，b结构域中的位点与a结构域位点相应位点互为功能等同位点。
9、需要说明的是，本申请所述硝基还原酶突变体氨基酸序列中的氨基酸位置参照野生型硝基还原酶bantr氨基酸序列中的氨基酸位置进行定位。
10、根据本申请的实施例，上述硝基还原酶突变体还包括下列技术特征的至少之一：
11、根据本申请的实施例，所述野生型硝基还原酶具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
12、matndnffnvlyertstrafnpnkeisstelheilkaaaqapsawnlqhwkflvfqgedvqkrlhpiaynqqqildasavvailgdleayknvepvygpiveqgfmkeeakerlakniesayareqfprdaafsnaslaamqlmlaakatgwdtcaiggfnpqaltdefnvssryvpimlitigestlkghpaprmsveqvsewak(seq id no:1)。
13、其中，编码野生型硝基还原酶的核酸具有如seq id no:2所示的核苷酸序列。
14、atggccacaaacgacaacttttttaacgttctatatgaacgcacatctacacgtgcattcaacccaaataaagaaatttcatctacagaattacatgagattttaaaagcagcagcacaagcaccttccgcttggaacttacaacactggaaattccttgtttttcaaggtgaagatgtacaaaaacgattacatccaatagcttataaccaacaacaaattcttgatgcttctgcagtagtcgctattttaggtgatttagaagcttataaaaatgttgagccagtatatggtccaatcgtagaacaaggatttatgaaagaagaagcaaaagaacgcttagctaaaaatattgaatctgcatatgctcgtgaacaattcccaagagatgctgccttttcaaatgcatctttagcagcaatgcaacttatgcttgcagctaaagcaactggttgggatacttgtgctattggtggcttcaatccacaagcactgacagacgaatttaacgtttcatctcgttacgttccaattatgcttattacaattggtgaatcaactttaaaaggccaccctgcacctcgcatgagcgtagagcaagtaagcgagtgggcaaaataa(seq id no:2)。
15、根据本申请的实施例，所述硝基还原酶突变体与所述野生型硝基还原酶具有至少80％的同一性。
16、根据本申请的实施例，所述硝基还原酶突变体与所述野生型硝基还原酶具有至少90％以上的同一性。
17、根据本申请的实施例，所述硝基还原酶突变体与所述野生型硝基还原酶具有至少95％以上的同一性。
18、根据本申请的实施例，所述硝基还原酶突变体与所述野生型硝基还原酶具有至少98％以上的同一性。一般而言，氨基酸序列的同一性越高表示其结构和功能越相似。
19、根据本申请的实施例，所述突变体具有以下突变：第15位氨基酸t突变为s或a或k或v；第69位氨基酸y突变为n或h或c；第172位氨基酸s突变为p；第173位氨基酸s突变为p或d。
20、根据本申请的实施例，所述突变体具有以下任意一种组合突变：第15位氨基酸t突变为s或a或k或v，第69位氨基酸不突变，第172位氨基酸不突变，第173位氨基酸不突变；或第15位氨基酸t突变为s或a或k或v，和以下三个位点具有至少一个位点氨基酸突变：第69位，第172位，第173位；或第69位氨基酸y突变为n或h或c，第15位氨基酸不突变，第172位氨基酸不突变，第173位氨基酸不突变；或第69位氨基酸y突变为n或h或c，和以下三个位点具有至少一个位点氨基酸突变：第15位，第172位，第173位；或第172位氨基酸s突变为p，第15位氨基酸不突变，第69位氨基酸不突变，第173位氨基酸不突变；或第172位氨基酸s突变为p，和以下三个位点具有至少一个位点氨基酸突变：第15位，第69位，第173位；或第173位氨基酸s突变为p或d，第15位氨基酸不突变，第69位氨基酸不突变，第172位氨基酸不突变；或第173位氨基酸s突变为p或d，和以下三个位点具有至少一个位点氨基酸突变：第15位，第69位，第172位。
21、根据本专利技术的一些具体实施例，不同的突变位点产生的硝基还原酶催化活性不同，可以为实际生产需要提供更多的选择。
22、根据本申请的实施例，所述突变体具有以下任意一种组合突变：第15位氨基酸t突变为a，第172位氨基酸s突变为p；或第69位氨基酸y突变为n；或第69位氨基酸y突变为h，第173位氨基酸s突变为p；或第69位氨基酸y突变为n，第173位氨基酸s突变为d；或第15位氨基酸t突变为k，第69位氨基酸y本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种硝基还原酶突变体，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述野生型硝基还原酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
3.根据权利要求1所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述突变体具有以下突变：
4.根据权利要求3所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述突变体具有以下任意一种组合突变：
5.根据权利要求4所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述突变体具有以下任意一种组合突变：
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～5任一项所述的硝基还原酶突变体。
7.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自pET系列载体、穿梭载体、噬菌体和病毒载体中的至少之一；
9.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求6所述的核酸分子或权利要求7～8任一项所述的表达载体。
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞选自大肠杆菌、酵母或哺
11.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株表达权利要求1～4任一项所述的硝基还原酶突变体。
12.一种制备硝基还原酶突变体的方法，其特征在于，包括：将权利要求9或10所述的重组细胞或权利要求11所述的重组菌株在适于蛋白表达的条件下进行培养处理，以便获得所述硝基还原酶突变体。
13.一种制备硝基还原酶突变体的方法，其特征在于，包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述突变处理选自随机突变和定点突变中的至少之一。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述硝基还原酶底物包括6-氯-2-甲基-5-硝基-2H-吲唑或其立体异构体、互变异构体和盐；
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述筛选处理包括获得相对活力高于对照组的硝基还原酶突变体；
17.一种制备硝基还原产物的方法，其特征在于，包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述硝基还原酶底物包括6-氯-2-甲基-5-硝基-2H-吲唑或其立体异构体、互变异构体和盐；
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，第二催化处理体系进一步包括氧化还原酶系统；
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第二催化处理是在5％的五氧化二钒水溶液中进行的；
21.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～5任一项所述的硝基还原酶突变体或权利要求6所述的核酸分子或权利要求7～8任一项所述的表达载体或权利要求9～10任一项所述的重组细胞或权利要求11所述的重组菌株。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括6-氯-2-甲基-5-硝基-2H-吲唑或其立体异构体、互变异构体和盐。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括5％的五氧化二钒水溶液、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP中的至少之一。
24.权利要求21～23任一项所述的试剂盒在制备硝基还原产物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种硝基还原酶突变体，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述野生型硝基还原酶具有如seq id no:1所示的氨基酸序列；
3.根据权利要求1所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述突变体具有以下突变：
4.根据权利要求3所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述突变体具有以下任意一种组合突变：
5.根据权利要求4所述的硝基还原酶突变体，其特征在于，所述突变体具有以下任意一种组合突变：
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～5任一项所述的硝基还原酶突变体。
7.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自pet系列载体、穿梭载体、噬菌体和病毒载体中的至少之一；
9.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求6所述的核酸分子或权利要求7～8任一项所述的表达载体。
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞选自大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞。
11.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株表达权利要求1～4任一项所述的硝基还原酶突变体。
12.一种制备硝基还原酶突变体的方法，其特征在于，包括：将权利要求9或10所述的重组细胞或权利要求11所述的重组菌株在适于蛋白表达的条件下进行培养处理，以便获得所述硝基还原酶突变体。
13.一种制备硝基还原酶突变体的方法，其特征在于，包括：
14.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：张琴，丰亚辉，王仲清，卢松泉，何方，李瑶瑶，
申请(专利权)人：广东东阳光药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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