【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及优化的枯草芽孢杆菌表达载体、含有该表达载体的基因工程菌及其应用。
技术介绍
1、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种重要的工业用非致病性微生物，属于革兰氏阳性菌。通过对该菌种的全基因组测序，让我们对枯草芽孢杆菌的遗传背景和生理特性有了清晰的认识，利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白具有诸多优点：(1)安全性高，可用于食品、药物等工业生产；(2)能直接将分泌蛋白释放到培养基中，利于分离纯化；(3)具有高效的分泌目的蛋白的能力，存在多种分泌途径，且途径中相关的分泌组分已经得到解析；其分泌的重组蛋白多数情况下依然能够保持天然构象和生物活性；(4)生长迅速，培养条件简单，遗传背景了解清晰，具有较好的工业生产基础。
2、穿梭型枯草芽孢杆菌表达载体是一类能够在两种不同宿主细胞(如枯草芽孢杆菌和大肠杆菌)中进行高效复制和表达的重组载体。这类载体因其能够在不同类型的细胞间实现基因转移与表达的能力，在分子生物学和基因工程中得到广泛应用。该表达载体的关键元件包括双启动子系统(分别调控基因在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达)、多克隆位点(mcs，用于灵活克隆和表达外源基因)、信号肽序列(如amyq，用于引导分泌型蛋白表达)、双复制子系统(适应两种宿主的复制起点)、选择标记基因(便于筛选成功转化的菌株)、终止子(如rrnb，增强mrna稳定性)，以及可选的复制增强元件(提高质粒拷贝数)，通过以上各表达元件的协同作用，穿梭型枯草芽孢杆菌表达载体不仅能在大肠杆菌中进行高效的质粒克隆和扩增，还能在枯
3、枯草芽孢杆菌表达载体的优化对于提高外源基因的高效表达至关重要，特别是在提升表达效率和稳定性方面。进一步优化表达载体的关键元件将为提升其在不同宿主中的表达效率和稳定性提供更多可能，从而推动基因工程研究的进展。通过精简未知功能的开放阅读框架(orf)减少代谢负担，将有助于提升宿主生长速率与载体稳定性，实现异源蛋白的高效表达，为工业和科研提供经济有效的解决方案。
4、当前，对于优化表达载体的关键元件，精简未知功能开放阅读框架以减少代谢负担的相关研究还较少，对于提升宿主的生长速率和载体稳定性、实现异源蛋白的高效表达具有显著意义。
5、因此，对枯草芽孢杆菌表达载体的未知功能开放阅读框架进行精简，优化枯草芽孢杆菌表达载体对于推动基因工程研究、提高工业生产效率以及降低成本都具有重要价值，为工业和科研提供经济有效的解决方案。
技术实现思路
1、本专利技术的目的提供一种枯草芽孢杆菌表达载体；
2、本专利技术的另一个目的是提供一种含有枯草芽孢杆菌表达载体的基因工程菌及其应用。
3、为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是：
4、本专利技术的目的在于通过对枯草芽孢杆菌表达载体中未知功能序列进行缩减优化，大幅度提高异源蛋白的表达水平。
5、具体地，所述优化的枯草芽孢杆菌表达载体为对核苷酸序列为seq id no:1的枯草芽孢杆菌表达载体缩减未知功能的序列从而获得所述优化的枯草芽孢杆菌表达载体，seq id no:1为：
6、
7、
8、
9、
10、进一步地，所述枯草芽孢杆菌表达载体为pma5质粒。
11、进一步地，所述缩减未知功能的序列选自orf序列；
12、进一步地，所述缩减的序列为seq id no:1中5213-5980bp区间，核苷酸序列为seqid no:2的orf-1；seq id no:2为：
13、
14、或所述缩减的序列为seq id no:1中2982-3510bp区间，核苷酸序列为seq id no:3的orf-2；seq id no:3为：
15、
16、进一步地，在本申请中还公开了一种基因工程菌，所述基因工程菌包含所述优化的枯草芽孢杆菌表达载体。
17、进一步地，在本申请中还公开了所述基因工程菌在异源基因编码蛋白发酵生产中的应用；
18、进一步地，所述异源基因编码蛋白为糖原合酶。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
20、在本申请中提供了一种通过对枯草芽孢杆菌表达载体中的未知功能开放阅读框架进行缩减从而达到优化枯草芽孢杆菌表达载体的方式，本申请中的载体以pma5质粒为基础，去除载体中未知功能的orf序列，实现了载体大小的缩减，减轻了细胞的表达负担，该优化后的载体在大肠杆菌内能够进行稳定复制，缩减ofr-1序列后得到的重组枯草芽孢杆菌菌株荧光强度较未缩减前提高了11％，缩减ofr-2序列后得到的重组枯草芽孢杆菌菌株，荧光强度较未缩减前提高了17％，证明对于提高异源基因编码蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达水平都具有明显作用。
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1.优化的枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于：通过对核苷酸序列为SEQ ID NO:1的枯草芽孢杆菌表达载体缩减未知功能的序列获得，
2.包含权利要求1所述优化的枯草芽孢杆菌表达载体的基因工程菌。
3.如权利要求2所述的基因工程菌在异源基因编码蛋白发酵生产中的应用。
4.如权利要求3所述的基因工程菌在异源基因编码蛋白发酵生产中的应用，其特征在于：所述异源基因编码蛋白为糖原合酶。
【技术特征摘要】
1.优化的枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于：通过对核苷酸序列为seq id no:1的枯草芽孢杆菌表达载体缩减未知功能的序列获得，
2.包含权利要求1所述优化的枯草芽孢杆菌表达载体的基因工程菌。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，付刚，游文慧，王誉桥，张楷，张淳瑶，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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