【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及一种优化工程化t细胞的碱基编辑系统及其应用，更具体地，涉及一种修饰或编辑工程化t细胞的碱基编辑系统和方法。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell，简称car-t细胞或car-t)是一种通过基因工程技术改造的t细胞，通过在t淋巴细胞基因组中整合针对某个靶点抗原表位(例如一些肿瘤细胞特异的抗原分子)的识别受体，并刺激t细胞的激活，从而增强t淋巴细胞对于特定肿瘤细胞的识别和杀伤能力。
2、car-t细胞根据改造的t细胞来源的不同，可以划分为两大类，分别是自体型car-t细胞和同种异体型(或称为现货型)car-t细胞；前者提取患者自身的t细胞进行改造，后者则是从健康的异源个体分离t细胞进行改造。两种类型的car-t细胞在实际应用时各有优劣。例如，自体型car-t细胞一个重要优势是，由于其来源于患者自身，因此在体外完成car基因的整合改造，回输到患者体内时往往具有较好的免疫效果且不会发生免疫排斥反应；然而，由于出现肿瘤细胞的患者体内，特别是在疾病发生的后期，健康的t细胞的数量相对有限，因此有时实际上难以从患者体内分离得到足够数量的t细胞并及时完成自体型car-t细胞的制备。现货型car-t细胞则可以从健康的捐赠者分离获得，从而在数量上可以有所保证，且供应的周期会更快，患者应用的成本会极大地降低，因此是一种极具潜力的新型car-t细胞疗法。然而，普通的现货型car-t细胞存在临床效果不佳的问题，这主要是由两方面的原因
3、然而，近年的研究发现，在现货型car-t细胞的功能改造和制备过程中，通过基因编辑的方法敲除一些基因，可以抑制免疫排斥反应以及gvhd的发生，同时还可以帮助提高现货型car-t细胞在输入患者体内后的扩增能力、肿瘤杀伤能力以及维持时长，以提升其临床效果。
4、例如，cish基因编码一种免疫负调节蛋白，其可以在nk细胞和t细胞中抑制il-15信号通路以抑制免疫反应。研究发现，下调cish基因的表达有助于t细胞的激活、生存和扩增(zhu et al.,2022.metabolic reprograming via deletion of cish in human ipsc-derived nk cells promotes in vivo persistence and enhances anti-tumoractivity.)。
5、fas基因编码的fas是一种受体蛋白，其与fasl蛋白互作，促进t细胞凋亡。研究发现，通过在car-t细胞中表达一种fas蛋白的显性负效应蛋白，破坏fas与fasl的互作，可以提升car-t细胞的维持时间，并提升其肿瘤杀伤效果(yamamoto et al.,2019.t cellsgenetically engineered to overcome death signaling enhance adoptive cancerimmunotherapy)。
6、tgf-β是一种在血液和许多肿瘤的免疫微环境中表达的抗炎因子。研究发现，tgf-β与tgfbr2基因编码的受体蛋白tbr2的结合可以引发下游信号通路的激活，抑制t细胞的激活和生存，从而抑制t细胞免疫(rouce et al.,2015.the tgf-β/smad pathway is animportant mechanism for nk cell immune evasion in childhood b-acutelymphoblastic leukemia)。而破坏tgf-β与受体tbr2的结合及互作，可以帮助提高t细胞的激活的生存能力(bollard et al.,2018.tumor-specific t-cells engineered toovercome tumor immune evasion induce clinical responses in patients withrelapsed hodgkin lymphoma)。因此，在适当的区域敲除tgfbr2基因可能有助于car-t细胞的应用效果。
7、此外，敲除免疫检查点蛋白pd-1也被报道可以促进t细胞的激活、扩增以及肿瘤杀伤效果(mcgowan et al.,2020.pd-1disrupted car-t cells in the treatment ofsolid tumors:promises and challenges)。trac的敲除则有助于消除gvhd反应，提高car-t细胞的生存能力和肿瘤杀伤效果(eyquem et al.,2017.targeting a car to the traclocus with crispr/cas9 enhances tumour rejection)。
8、虽然已经有报道，敲除这些基因中的单个或者某几个，用于提升car-t细胞的使用效果，然而，尚没有利用碱基编辑同时敲除以上5个基因的报道。
9、碱基编辑(base editing)是指通过基因工程手段对特定dna位点进行核苷酸替换的过程，碱基编辑是基因编辑(genome editing)技术的一种。在人体和动物中，许多遗传疾病是由功能基因上的点突变引起的。碱基编辑技术，可以对动植物、微生物的基因组dna进行靶向修饰和改造，以创制新的基因型并获得有益于生产应用的目标性状，也可在遗传疾病治疗中被用于纠正一些严重的先天性遗传变异，因而碱基编辑在优良种质创制和疾病治疗中具有重要的应用前景。
10、碱基编辑是借助于碱基编辑系统(base editor)实现的，根据碱基编辑系统所作用的碱基类型，可以将碱基编辑系统划分为两类，分别是：1)胞嘧啶碱基编辑系统(cytosine base editor，cbe)和2)腺嘌呤碱基编辑系统(adenine base editor，abe)。其中，cbe可以作用于胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(简称胞苷，c)上的胞苷碱基，而abe可以则作用于腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(简称腺苷，a)上的腺苷碱基。cbe编辑可以将双链dna上的c-g碱基对转换为t-a碱基对；abe编辑可以将双链dna上的a-t碱基对转换为g-c碱基对。
11、目前仍需精准有效、稳定安全的碱基编辑系统来对car-t细胞进行进一步优化，提升car-t细胞的生存、扩增、维持、激活以及肿瘤杀伤性能，同时有效抑制甚至消除免疫排斥反应或者gvhd反应。
技术实现思路
1、专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种获得修饰的T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括通过基因编辑技术敲除或下调表达T细胞的内源基因，其中所述内源基因包括T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因、转化生长因子β受体2(TGFBR2)基因、程序性死亡受体1(PD-1)基因、含细胞因子诱导型SH2蛋白(CISH)基因和细胞自杀相关因子(FAS)基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括对基因靶点进行DNA插入、删除或替换，优选的，所述基因编辑技术为对基因靶点进行DNA替换。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括单碱基编辑。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述TRAC基因的原间隔子序列包括SEQ IDNO:51；所述TGFBR2基因的原间隔子序列包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28；所述PD-1基因的原间隔子序列包括SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44、
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述TRAC基因的原间隔子序列包括SEQ IDNO:51；所述TGFBR2基因的原间隔子序列包括SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:28；所述PD-1基因的原间隔子序列包括SEQ ID NO:41、或SEQ ID NO:47；所述CISH基因的原间隔子序列包括SEQ ID NO:1；所述FAS基因的原间隔子序列包括SEQ ID NO:14。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽包括DNA结合蛋白和至少一个脱氨酶结构域。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽还包括至少一个尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)结构域。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽还包括核定位序列。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氨酶选自胞苷脱氨酶，任选地，所述胞苷脱氨酶选自SCP1.201家族脱氨酶，可选地，所述SCP1.201家族脱氨酶选自Sdd2、Sdd3、Sdd4脱氨酶、Sdd6脱氨酶、Sdd7脱氨酶、mini-Sdd7脱氨酶、mini-Sdd9脱氨酶、Sdd10脱氨酶、Sdd59脱氨酶、mini-Sdd3脱氨酶或mini-Sdd6脱氨酶。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氨酶为Sdd7和/或mini-Sdd9胞苷脱氨酶。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA结合蛋白选自选自TALE、ZFP或CRISPR效应蛋白或其变体；任选的，所述CRISPR效应蛋白选自Cas9切口酶、失活Cas9或其变体。
13.根据权利要求4-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽包含与SEQ ID NO:74-80中任一项具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的氨基酸序列。
14.根据权利要求4-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括引入编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述嵌合抗原受体(CAR)包括抗原结合结构域、跨膜结构域。
15.根据权利要求4-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述T细胞群是来自人的T细胞，任选的，是来自于从人血细胞富集的T细胞，可选的，是来自于从人血细胞富集的、冻存的T细胞。
16.根据权利要求4-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述导入的方法包括电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或其他病毒)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)介导、基因枪法介导、核糖核蛋白(RNP)复合物介导、纳米粒子介导的转化。
17.一种修饰T细胞的碱基编辑系统，包括：
18.根据权利要求17所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述脱氨酶结构域为胞苷脱氨酶。
19.根据权利要求18所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述胞苷脱氨酶选自APOB...
【技术特征摘要】
1.一种获得修饰的t细胞的方法，其特征在于，所述方法包括通过基因编辑技术敲除或下调表达t细胞的内源基因，其中所述内源基因包括t细胞受体α链恒定区(trac)基因、转化生长因子β受体2(tgfbr2)基因、程序性死亡受体1(pd-1)基因、含细胞因子诱导型sh2蛋白(cish)基因和细胞自杀相关因子(fas)基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括对基因靶点进行dna插入、删除或替换，优选的，所述基因编辑技术为对基因靶点进行dna替换。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括单碱基编辑。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述trac基因的原间隔子序列包括seq idno:51；所述tgfbr2基因的原间隔子序列包括seq id no:21、seq id no:24、seq id no:27、或seq id no:28；所述pd-1基因的原间隔子序列包括seq id no:41、seq id no:44、seq idno:45、seq id no:46、或seq id no:47；所述cish基因的原间隔子序列包括seq id no:1、seq id no:5、seq id no:8、或seq id no:10；所述fas基因的原间隔子序列包括seq idno:14、seq id no:17、seq id no:18、或seq id no:20。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述trac基因的原间隔子序列包括seq idno:51；所述tgfbr2基因的原间隔子序列包括seq id no:24、或seq id no:28；所述pd-1基因的原间隔子序列包括seq id no:41、或seq id no:47；所述cish基因的原间隔子序列包括seq id no:1；所述fas基因的原间隔子序列包括seq id no:14。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽包括dna结合蛋白和至少一个脱氨酶结构域。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽还包括至少一个尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂(ugi)结构域。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽还包括核定位序列。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氨酶选自胞苷脱氨酶，任选地，所述胞苷脱氨酶选自scp1.201家族脱氨酶，可选地，所述scp1.201家族脱氨酶选自sdd2、sdd3、sdd4脱氨酶、sdd6脱氨酶、sdd7脱氨酶、mini-sdd7脱氨酶、mini-sdd9脱氨酶、sdd10脱氨酶、sdd59脱氨酶、mini-sdd3脱氨酶或mini-sdd6脱氨酶。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氨酶为sdd7和/或mini-sdd9胞苷脱氨酶。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述dna结合蛋白选自选自tale、zfp或crispr效应蛋白或其变体；任选的，所述crispr效应蛋白选自cas9切口酶、失活cas9或其变体。
13.根据权利要求4-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基编辑多肽包含与seq id no:74-80中任一项具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的氨基酸序列。
14.根据权利要求4-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括引入编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，所述嵌合抗原受体(car)包括抗原结合结构域、跨膜结构域。
15.根据权利要求4-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述t细胞群是来自人的t细胞，任选的，是来自于从人血细胞富集的t细胞，可选的，是来自于从人血细胞富集的、冻存的t细胞。
16.根据权利要求4-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述导入的方法包括电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或其他病毒)、n-乙酰半乳糖胺(galnac)介导、基因枪法介导、核糖核蛋白(rnp)复合物介导、纳米粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：KT赵，胡佳成，
申请(专利权)人：北京齐禾生科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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