【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于酶的基因工程，具体涉及一种磷脂酶d突变体及其制备与应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、磷脂是一类含有磷酸官能团的脂质分子，它们是构成生物膜的基本成分，主要包括甘油磷脂和鞘磷脂两大类。其中甘油磷脂根据其极性头部基团的差异，可以划分为磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)和磷脂酸(pa)等。磷脂参与细胞信号化、多种酶促反应和能量代谢，代表了生命出现过程中的一个进化和不可忽视的步骤。由于其众多的营养和生物活性功能，磷脂被广泛用于食品、药品和化妆品行业。ps是一种天然甘油磷脂，具有多种生理功能，如缓解情绪、提高记忆力等。目前，ps已被我国卫生健康委员会批准为新资源食品之一。ps的制备方法有物理提取法、化学合成法和生物酶法。但是由于前两种方法工艺复杂、产率低、毒性高、纯化困难，并且可能导致环境污染，不适用于ps的规模生产。生物酶法是利用磷脂酶d(phospholipase d，pld)催化pc和l-serine之间的转酯反应来合成ps的方法。操作步骤简单，反应条件温和，无需高温高压等苛刻条件，合成过程中不产生有害废物，符合绿色化学和可持续发展的要求，具有产品安全性高等优点，因此，利用酶法催化合成ps具有广阔的应用前景。
2、磷脂酶d(pld，ec.3.1.4.4)是一种大量存在于植物、动物和微生物中常见的酶。1947年hanahan和chaikoff首次在胡萝卜和白菜叶子中发现了pld，随后人们相继从各种植物的根、叶子和种子等器官中发
3、蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。蛋白质工程通常分为非理性设计和理性设计。非理性设计是利用易错pcr、dna重组、错列延伸法和非同源随机重组策略等技术对整个序列进行突变和筛选，此方法既不需要了解目的蛋白质的三维结构也不需要相关的结构-功能信息，但该方法筛选工作较为繁琐。而理性设计则需要对蛋白质的结构和功能有深刻的理解，随着分子动力学模拟和量子化学计算等技术的发展，理性设计可以精确地设计蛋白质的突变或结构变化。相较于非理性设计，理性设计工作量小，并且可以减少无效突变，能够在较短时间内获得具有优异性能的突变体。
4、芽孢杆菌表达系统(如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)作为一种安全、高效和极具开发潜力的基因工程表达系统已被广泛地应用于各个领域。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可直接将目的蛋白分泌到胞外，从而进一步降低目的蛋白分离纯化的成本和工作量。随着分子生物学技术的发展和对芽孢杆菌的深入研究，很多种工业酶都在芽孢杆菌表达系统中实现表达，并成功进行大规模工业化生产。
5、因此，在本专利技术中，通过对来源于抗生素链霉菌的磷脂酶d基因进行分子改造，得到酶活力提高的磷脂酶d突变体基因，并实现了在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的表达。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术的目的是针对现有的技术问题，对磷脂酶d(pld)进行分子改造以获得转酯活力提升的突变体，实现其在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌系统中的表达。
2、实现本专利技术目的的技术路线概述如下：
3、通过分子生物学手段获得来自抗生素链霉菌tccc 21059的野生型磷脂酶d(pld)，通过酶切、连接等构建重组载体，经测序获得野生型pld编码基因pld(序列如seq id no.2所示)，通过分子动力学模拟等方法理性设计获得pld突变体h443n/s199h及其编码基因pldm，该突变体是将第443位组氨酸突变为天冬酰胺，将第199位丝氨酸突变为组氨酸，活力提高到野生型的3.14倍。利用枯草芽孢杆菌wb600、解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.11218、地衣芽孢杆菌2709实现了突变体h443n/s199h的高效制备与应用。
4、本专利技术提供的技术方案之一，是一种pld突变体，所述突变体是在seq id no.1所示的野生型pld上发生h443n和s199h突变获得的，将所述突变体命名为h443n/s199h；
5、进一步地，本专利技术所述pld突变体为h443n/s199h，氨基酸序列如seq id no.3所示；
6、更进一步地，所述h443n/s199h突变体的编码基因pldm，核苷酸序列如seq idno.4所示。
7、本专利技术提供的技术方案之二，是包含上述pld突变体编码基因的重组载体或重组菌株；
8、进一步地，所述重组载体使用的表达载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pbsa43；
9、进一步地，所述重组菌株使用的宿主为枯草芽孢杆菌wb600、解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.11218和地衣芽孢杆菌2709。
10、本专利技术提供的技术方案之三，是上述重组载体或重组菌株的应用，特别是在生产seq id no.3所示pld突变体中的应用。
11、本专利技术提供的技术方案之四，是seq id no.3所示pld突变体的应用，特别是在制备甘油型磷脂及其衍生物中的应用，更特别的是在制备磷脂酰丝氨酸(ps)中的应用；
12、更进一步地，所述pld突变体的应用形式包括但不限于酶液、酶粉、乳液、凝胶以及固定化酶等。
13、有益效果：
14、1.专利技术利用重叠pcr技术对野生型pld进行定点突变，突变体h443n/s199h比活力是野生型pld的3.14倍，催化磷脂酰胆碱和丝氨酸得到磷脂酰丝氨酸的产率为野生型pld的2.01倍。
15、2.本专利技术分别使用了枯草芽孢杆菌表达系统、解淀粉芽孢杆菌表达系统、地衣芽孢杆菌表达系统，实现pld突变体不同方式的高效表达。
16、在本专利技术中采用如下定义：
17、1.氨基酸和dna核酸序列的命名法
18、使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母/单字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。
19、2.磷脂酶突变体的标识
20本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，所述磷脂酶D突变体是将野生型磷脂酶D氨基酸序列的第443位组氨酸突变为天冬酰胺，第199位丝氨酸突变为组氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种磷脂酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与权利要求1的SEQIDNo.3所述序列具有75％以上的同源性。
3.一种磷脂酶D突变体的编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述磷脂酶D突变体。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.包含权利要求3所述编码基因的重组载体或重组菌株。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，采用的表达载体为包括不限于pBSA43。
7.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主菌包括不限于枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218和地衣芽孢杆菌2709。
8.权利要求5所述重组载体或重组菌株的应用。
9.权利要求1所述磷脂酶D突变体的应用。
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...【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶d突变体，其特征在于，所述磷脂酶d突变体是将野生型磷脂酶d氨基酸序列的第443位组氨酸突变为天冬酰胺，第199位丝氨酸突变为组氨酸，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.一种磷脂酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与权利要求1的seqidno.3所述序列具有75％以上的同源性。
3.一种磷脂酶d突变体的编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述磷脂酶d突变体。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.4所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，黄芷琪，孙慧，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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