【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脱毒苗培育，具体涉及一种小黄姜脱除病毒及内、外源菌的方法。
技术介绍
1、姜( zingiber offcinaleroscoe)为姜科多年生草本植物，又称生姜、黄姜等，在我国中部、东南至西南各省区广为栽培。姜分为小种姜、大种姜、山姜(野姜)等品种，习惯把小种生姜叫“小黄姜”，小黄姜具有切面纯黄色，味辛辣浓，肉细嫩，味香，纤维较细等独特优点，深受人们的喜爱。烟草花叶病毒（tmv）、黄瓜花叶病毒（cmv）是侵染姜的主要病毒，枯假单胞杆菌是侵染姜的主要病菌。内源菌污染是植物材料内部（细胞内或细胞间）的微生物（如内生细菌、真菌等）不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，如仙客来的块茎组培内生菌污染率达83％。病毒和病菌在姜体内积累，导致姜品种的种性退化，姜叶色褪绿、畸形以及植株矮化等症状，抗性和品质降低，已成为姜产业发展中的主要制约因素之一。造成最终导致姜减产30％，严重时减产达 45％以上，连作可导致发病率高达80%，甚至绝收。
2、高温茎尖脱毒是一种利用病毒是蛋白质特性而产生的，利用高温处理可以钝化或抑制病毒的繁殖，由于植物病毒是通过维管系统进行传播的，而茎尖分生组织中没有维管系统，因此顶端分生组织中一般没有病毒或者含有极少量的病毒。
3、前人研究者在不同植物中采用的高温处理方法主要有以下三种：“张舒婷.小黄姜脱毒快繁体系的优化[d]. 成都：四川农业大学，2023”把生姜姜芽置于50ºc水浴10 min后剥离茎尖进行组织培养；“
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种小黄姜脱除病毒及内、外源菌的方法。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
3、s1、选择生长健壮肥厚，无损伤、无病虫害的姜块作为外植体材料，置于28-30℃黑暗环境下催芽；
4、s2、待姜芽长至2-3cm，挑选健康饱满的姜芽，切下后流水冲洗，放置到超净工作台消毒，采用0.1%升汞消毒30 min，采用无菌水冲洗3遍；
5、s3、在无菌条件下，将消毒好的姜芽转移到初代培养基中，采用高低温脱毒方法筛除带菌姜苗，当姜芽发育长出1-3片胚芽鞘时结束培养；其中培养基配方为：ms+0.2mg/lba+0.02mg/lnaa+30g/l蔗糖+8.5g/l卡拉胶，ph6.0-6.4；高低温脱毒具体为：高温35-40℃15d，低温15-18℃10d（温度的控制通过培养室中的空调来调节），光照强度1500lux；
6、说明：通过本阶段的高低温培养后，培养基中会出现三种情况：
7、（1）由于外植体消毒不彻底，或者操作不规范导致外植体污染，其特点是外植体和培养基上会生长大量的微生物霉菌，污染源来自外在细菌，见图1。
8、（2）由于外植体本身带有的内源菌、外源菌及病毒导致的污染，其特点是在培养基中呈现出粉红色、蓝色、灰色、腐烂、培养基中产生气泡或者培养基变得浑浊（姜芽含有的内源菌和外源菌种类不同出现的现象会不同），污染源是姜芽本身自带的内源菌和外源菌，这些外植体也会被筛除，见图2。
9、（3）姜芽发育良好，无任何污染，培养基干净、清亮，透明。这类姜芽就是不含内源和外源菌的健康外植体，用于下一步的茎尖剥离，见图3。
10、s4、在无菌条件下，将初筛后健康的姜芽剥去叶芽鞘，从生长点切下1-3mm茎尖，转移至丛芽诱导培养基中进行增殖培养，培养温度20-25℃，光照强度2500lux，培养8-15d；其中培养基配方为ms+3mg/lba+0.2mg/lnaa+30g/l蔗糖+8.5g/l卡拉胶，ph 6.0-6.4；
11、s5、将增殖后获得的丛生苗从基部分切成单苗，放置到生根培养基中，到的脱毒植物，培养温度22-25℃，光照强度3000 lux，培养30-45d，培养基配方为ms+0.02mg/lnaa+30g/l蔗糖+8.5g/l卡拉胶，ph 6.0-6.4。
12、s3中较大的姜芽切成两半，培养基采用袋装。
13、在初代培养基中，通过高低温处理，筛选出不含内、源菌的健康姜芽，培养基中固化剂使用的是卡拉胶。
14、本专利技术是采用高低温处理法+茎尖脱毒法获得无菌种苗。具体做法是将消毒后的外植体（2-3cm的姜芽）置于初代培养基中，在无菌组培室中培养，通过空调控制室内温度35-40℃高温处理15d，随后调节至15-18℃低温处理10d，取健康姜芽在无菌环境中剥离茎尖生长点1-3mm进行培养。本方法明显与其他方法不同，至今未见报道。
15、有益效果：
16、（1）本专利技术全程在无菌环境下操作，减少了外植体间的交叉污染，降低愈伤组织诱导和增殖培养期的污染率；
17、（2）在初代培养基（ms+0.2mg/lba+0.02mg/lnaa+30g/l蔗糖+8.5g/l卡拉胶，ph6.0-6.4）中35-40℃高温处理15d时，由培养基提供营养，促进姜芽茎尖生长点细胞分裂加快、伸长；15-18℃低温培养10d，抑制茎尖生长点过快生长，使茎尖生长点变的健壮；切取茎尖生长点长度可以达到1-3mm（常规的操作仅能取生长点0.1-0.3mm），大大提高了工作效率和茎尖生长点组培的成活率，而前人研究发现茎尖生长点越小，成活率越低。
18、（3）通过高温处理，一方面可以钝化和抑制病毒的繁殖，另一方面可以筛除大量含有内、外源菌的外植体材料。其原理是：外植体中的内、外源菌大量繁殖，消耗姜芽中的营养物质，产生大量的排泄物。随后通过15-18℃低温培养10 d，排泄物释放到培养基中，在培养基中出现粉红色、黄绿色、灰色、晕状物、气泡及培养基浑浊等的外植体，均是含有内、外源菌，在此环节均会被筛除（含有内、外源菌的外植体，在组培早期往往会出现增殖效率降低，培养物生长减慢、玻璃化苗，后期导致试管苗移栽困难和死亡，也会引起培养物的遗传变异）。
19、（4）通过高低温处理后，可筛选出姜芽生长健壮、培养基透亮、无污染的外植体进行茎尖生长点的剥离。由于前期筛除了带菌外植体，剥离出的生长点形成的愈伤组织多，生长快，后期的污染率、组培苗褐化和玻璃化苗得到明显控制（通过高温或低温处理可以减少褐化率），繁殖系数也得到了明显提高，达到了10.64。在前人的姜组培研究中，姜的繁殖系数本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种小黄姜脱除病毒及内、外源菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的小黄姜脱除病毒及内、外源菌的方法，其特征在于：在初代培养基中，通过高低温处理，筛选出不含内、源菌的健康姜芽，培养基中固化剂使用的是卡拉胶。
【技术特征摘要】
1.一种小黄姜脱除病毒及内、外源菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的小黄姜脱除病毒及...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟衡玲，谢庆华，杨生超，秦琪书，张薇，滕志，李莹，施娴，白宏伟，杨庆华，惠王珂，邓县斌，何林园，
申请(专利权)人：红河学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。