【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用。
技术介绍
1、逆转录酶是使用rna为模板合成dna的酶，被广泛应用于科学研究以及从病原体检测到转录组分析各种场景，涉及rt-pcr、rt-qpcr、rt-lamp、cdna文库构建等多种技术。在已知的逆转录酶中，来自moloney鼠白血病病毒的逆转录酶(mmlv rt)是使用最广泛也是最知名的一种。相较于其他逆转录酶，mmlv逆转录酶具有更强的逆转录活性，并且表达纯化工艺更适于商业化。但mmlv逆转录酶野生型存在明显的缺陷，其最适反应温度是37-42℃，高温下极易失活。
2、而作为模板的rna容易形成二级结构，这对于逆转录过程来说是极不利的，二级结构可能会导致逆转录过程提前终止，或者合成的cdna不完整、产量少及存在偏好性等问题。提高逆转录的反应温度则有助于打开rna的二级结构，改善cdna产物的质量，但能打开rna二级结构的温度往往也让逆转录酶失活，因此提高mmlv逆转录酶的热稳定性势在必行。另外，mmlv逆转录酶热稳定性的提升，往往也伴随着在高温下反应活性的提高和存储稳定性的提高，从而使技术更优越、使运输存储更便利。
3、综上所述，目前现有野生型mmlv逆转录酶存在热稳定性差、无法耐高温，难以适用于多种技术(如高温逆转录反应，高温rt-qpcr及高温rt-lamp)应用场景等问题。如何提供一种热稳定性优异，高温下催化活性高的鼠白血病病毒逆转录酶突变体已成为目前生物
亟待解决的问题之一。
技术实现思路b>
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用，解决了现有野生型mmlv逆转录酶存在的热稳定性差、无法耐高温，难以适用于高温逆转录反应，高温rt-qpcr及高温rt-lamp等问题，获得的突变型逆转录酶展示出提高的热稳定性、更高温度下的反应活性和/或额外的有益特性(提高的存储稳定性、提高的运输稳定性、改进的复杂结构rna模板的cdna合成能力或提高的特异性)。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下位点突变：
4、a46、s60、v88、s92、p100、v101、r121、p127、h143、k152、p166、r211、d216、a229、d339、q341、t420、l452、m457、t467、a500、g504、a539、l563、a589、l604、t605、s606、g608、e616、q639或a646中的任意一个或至少两个的组合。
5、优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下位点突变：
6、a46p、s60k或s60r或s60h、v88k或v88r或v88h、s92c、p100v或p100g或p100s或p100a或p100y、v101g或v101i或v101c或v101n或v101f或v101k或v101r或v101y、r121c、p127s、h143c、k152i或k152q或k152e或k152d、p166c、r211s、d216q、a229c、d339e、q341e或q341d、t420v、l452c或l452k或l452r或l452h、m457c、t467n、a500p、g504p或g504s、a539c、l563c、a589k或a589r或a589h、l604n或l604d或l604e或l604y或l604g、t605i或t605s或t605p或t605v或t605d或t605e或t605r或t605k、s606f或s606v或s606h或s606g或s606r或s606k、g608m或g608s、e616c、q639c或a646c中任意一种或至少两种的组合。
7、优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下突变：
8、s60、p100、v101、k152、r211、d216、d339、t420、l452、m457、l563、l604、t605、s606、g608、e616中任意一种或至少两种的组合。
9、优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下位点突变：
10、s60k或s60r或s60h、p100v或p100g或p100s或p100a或p100y、v101g或v101i或v101c或v101n或v101f或v101k或v101r或v101y、k152i或k152q或k152e或k152d、r211s、d216q、d339e、t420v、l452c或l452k或l452r或l452h、m457c、l563c、l604n或l604d或l604e或l604y或l604g、t605i或t605s或t605p或t605v或t605d或t605e或t605r或t605k、s606f或s606v或s606h或s606g或s606r或s606k、g608m或g608s或e616c中任意一种或至少两种的组合。
11、优选地，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上还发生包括如下突变：
12、m39、s56、m66、l99、d108、p111、l139、d200、t287、t330、p448、d449、s453、n479、a502、d524、h594、l603、i611、l630、h634、d653、l671中任意一种或至少两种的组合。
13、优选地，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上还发生包括如下位点突变：
14、m39v、s56c、m66l、l99f或l99v或l99y或l99n或l99g或l99c、d108i或d108l或d108c或d108h、p111l、l139p、d200h或d200q、t287a、t330p、p448c、d449g、s453k、n479d、a502v、d524a、h594k、l603w、i611k或i611r或i611h、l630p、h634y、d653t或l671p中任意一种或至少两种的组合。
15、优选地，所述突变体氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：
16、(1)l563c、g608s、e616c、h634y和d653t；
17、(2)s60r、d200q、a229c、s453k、d524a、l604n、t605d、g608m和i611r；
18、(3)d200q、a229c、t467n和l671p；
19、(4)s60r、p127s、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列SEQ IDNO.1的基础上发生包括P100和/或V101位点突变：
2.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体与SEQ ID NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上还发生包括如下突变：
3.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1-3中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求4所述的核酸分子和/或权利要求5所述的重组载体。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体；
8.权利要求1-3中
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述逆转录反应包括RT-PCR、RT-qPCR或RT-LAMP中的任意一种。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体保留逆转录酶活性；
...【技术特征摘要】
1.一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列seq idno.1的基础上发生包括p100和/或v101位点突变：
2.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上还发生包括如下突变：
3.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1-3中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码序列。
...【专利技术属性】
技术研发人员：刘想，商曰朋，刘峰，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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